195533. lajstromszámú szabadalom • Eljárás génsebészeti úton módosított mikroorganizmusok előállítására amiláz előállítás céljára
1 195 533 2 (Bacillus megaterium) is tenyésztjük, és meghatározzuk enzim-aktivitását. A tenyészet enzim-aktivitását a DNS- módszcrrel határozzuk meg, egy enzimegység az az. enzimmennyiség, amely 1 mg redukáló cukrot (referens vegyület a maltóz) termel, percenként. 10 perces inkubációs időt használunk. A szubsztrát nagymértékben tisztított amiláz. A donor mikroorganizmus 10 liter tenyészetben 66,0 egység enzimet termel. Az E. coli CL 7001 (pCP 1) törzs telített tenyészetben literenként 116,6 egység enzimet termel, ugyanakkor tenyésztést (amplifikálást) követően 5 órás inkubáció kloramfenikol jelenlétében, majd 15 órás inkubáció kloramfenikol nélkül literenként 84,5 egység enzimet eredményez. A fenti adatok azt jelzik, hogy a telített tenyésztés módszere megfelelő nagymennyiségű enzim termelésére. Az E. coli CL 7001 (pCP 1) törzs által termelt enzimet a-amiláznak találtuk, az enzim az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik. Mind az amilózt, mind az amilopektint glükózzá, maltózzá és maltotriózzá, elsősorban maltózzá bontja, hasítja mind a ciklodextrint és a maltotriózt, mégpedig glükózzá és maltózzá. A pullulánt panózzá és/vagy izo-panózzá hasítja, hasonlóan a közelmúltban leírt enzimhez [Shimizu, Kanno, Tamura és Suekane, Purification and Some Properties of a Novel Alpha-Amylase Produced by a Strain of Thermoactinomyces vulgaris, Agric. Biol. Chem., 42, (9), 1681— 1688. oldal, (1978)]. Az itt Bacillus megaterium-nak nevezett mikroorganizmust először Bacillus circulans-nak gondoltuk. 2. példa A hőtűrő a-amiläz gén klónozása A donor mikroorganizmus eredeti törzse a Bacillus nemnek, komposztból izoláltuk, és Bacillus coagulansnak határoztuk meg. Hőálló a-amilázt termel, és az alábbi mikrobiológiai tulajdonságokkal rendelkezik: 1) Morfológia: Pálca (0,6 1 pX2,5- 5,0 p). mozgó, gram-pozitív festődésű, és gram-negatív festődésü. A spórák centrális vagy terminális állásúak, nem deformálódnak. 2) Táp-levesen: jól növekszik. 3) Táp-agar-ferdén: jó növekedés, szálas, szétszóródó, krémfehér színű. 4) Szerves savak hasznosítása: citrát: pozitív, malonát: negatív. 5) Zselatin: elfolyósítja. 6) Az acetil-metil-karbinol (acetoin) termelés: pozitív. 7) Orto-nitro-fenil-galaktozid hidrolízise: pozitív, 8) Nitrátok redukciója: pozitív, gáz keletkezhet. 9) Kataláz-reakció: pozitív. 10) Indol-termelés: negatív. 11) Dekarboxiláz-reakció lizinen: negatív, ornitinen: negatív, argininen: negatív. 12) Kén-hidrogén termelés: negatív. 13) A szénhidrát hasznosítási spektrum: hasznosítja az arabinózt, galaktózt, glükózt, levulózt, mannózt, maltózt, szaccharózt, keményítőt, trehalózt és ezekből savat termel. 14) A pullulánt minimál táptalajon hasznosítja. 15) A poliolok hasznosítása: hasznosítja a glicerint, a szorbitot, a mannitot, inozitot. Nem hasznosítja az adonitot és a dulcitot. 16) Ureolízis: negatív. 17) Lecitin-hasznosítás: negatív. 18) Optimális növekedési hőmérséklet: 50 °C. Növekedés még bekövetkezik: 55—60 °C. Növekedés még van: 15—25 °C. 19) Oxigén-igény: aerob és anaerob. A törzset 1980. február 12-én NCIB 11571 sorszámon letétbe helyeztük az NCIB törzsgyűjteményébe. A törzsből származó dezoxi-ribonukleinsavat izoláljuk, és az. alábbi restrikciós enzimekkel hasítjuk: Eco Rí; Hind III; Pst I; Sal I; Bam HI és Bgl II. Különböző molekulasúlyú, nagyszámú fragmenst csak a Bgl II enzimmel kapunk. Ugyanakkor az Eco RI enzimmel is lehetséges fragmensek előállítása, ha a nátrium-klorid koncentrációt 50 mmól-ra csökkentjük. Úgy határoztunk, hogy az Eco RU enzimet használjuk fragmensek előállítására, és ezeket klónozzuk, az Eco RI lambda dezoxi-ribonukleinsav vektorba (lambda NM 781). A) A B. coagulans és az NM 781 lambda-fág dezoxiribonukleinsavának restrikciója 1,25 pg NM 781 lambda dezoxi-ribonukleinsavat hasítunk 1 egység Eco Rí enzimmel. 25 pl az alábbi pufferrel készült reakcióelegyben: 10 mmól trisz-hidrogén-klorid (pH 7,5), 10 mmól 2-merkapto-etanoI, 10 mmól magnézium-szulfát, és 10 mmól nátrium-klorid. 2 pg B. coaguláns dezoxi-ribonukleinsavat hasítunk hasonló enzimmel, és hasonló pufferrel készült reakcióelegyben, azzal a különbséggel, hogy a nátrium-klorid koncentrációt 50 mmól-ra csökkentjük. Az inkubációt 2 órán át 37 °C hőmérsékleten végezzük, és a reakciót oly módon állítjuk le. hogy az elegyet 10 percen át 75 °C hőmérsékleten tartjuk. A restrikció teljességét 1% agarózt tartalmazó gélen elektroforézissel bizonyítjuk. B) A rekombináns fágok ligációja és kinyerése A hasított dezoxi-ribonukleinsavakat összekeverjük, és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal kapcsoljuk őket olyan reakcióelegyben, amely 60 mmól trisz-hidrogén-kloridot (pH 8), 10 mmól magnézium-szulfátot, 10 mmól 2-merkapto-etanolt és 0,1 mmól ATP-t tartalmaz. A reakciót 10—15 órán át 10 °C hőmérsékleten végezzük. A ligációs reakciót követően 0,2 pg dezoxiribonukleinsav alikvotot keverünk ATP-vel, ennek végkoncentrációja 10-2 mól. Az alikvotokat in vitro enkapszidációnak vetjük alá, és felhasználjuk a terméket az E. coli HB 101 törzs fertőzésére. Egy pg lambda dezoxi-ribonukleinsavra számítva 1,6 X104 plakk-képző egységet kapunk. A fágok között egyesek amiláz-aktivitással rendelkeznek (az amiláz aktivitás petri-csészén való meghatározását, a kinyerést és a fágok tisztítását az 1. példában megadottak szerint végezzük). Igen nagy mennyiségű amilázt termelő fágot kapunk (400-ból 1 -et). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
