195533. lajstromszámú szabadalom • Eljárás génsebészeti úton módosított mikroorganizmusok előállítására amiláz előállítás céljára
1 195 533 2 lambda bakteriofág, és az összes használt vektor géntérképét, az új rekombináns plazmidokat a következő példák szerint. Részletesebben, az 1. ábra mutatja az NM 590 lambdafág (b), az NM 781 lambdafág (c) géntérképét (Murray, Brammar és Murray, Molec. gén. Genet, 150, 53-61., 1977). A 2. ábrán a pBR 322 plazmid géntérképét mutatjuk be (Bolivar, Rodriguez, Greene, Betlach, Heyneker, Boyer, Gene, 2, 95-113, 1977) és a pAYC 184 plazmid genetikai térképét (Chang, Cohen, J. Bact., 134, 1141—1156, 1978). A 3. ábrán láthatjuk az új pCP 1 plazmid térképét, és a 4. ábrán az új pCP 2 plazmid géntérképét. Az 5. ábra a II A. példában bemutatottakat szemlélteti, látható a pC 194, pCP 2.3, és a végső új plazmid, a pCH 1. A 6. és a 7. ábrán sorrendben bemutatjuk a pCP 3 és pCP 4 plazmidokat. Az új rekombináns plazmidokat bemutató összes genetikai térképen a donor dezoxi-ribonukleinsavat vastag vonallal jelöltük. A példánkban szemléltetjük a találmány szerinti eljárást. A példákat csak szemléltető jelleggel adjuk meg, és a találmány oltalmi körét nem szűkítik. A %^kat súly%ban adjuk meg, kivéve, ha másként nem jelöljük. Az összes példát az NIH (National Institute of Health) (USA) szabályai szerint végeztük. Az a-amiláz gén klónozása A kísérletek során az alábbi anyagokat használjuk: Hind III restrikciós endonukleáz (Boehringer Ingelheim): T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz (Boehringer Ingelheim, NSZK). NM 590 lambda-fág. A fág dezoxi-ribonukleinsavát nagymértékben tisztított fágrészecskékből izoláljuk fenolos extrakcióval, lásd Murray és munkatársai, Molec. Gen. Genet. 150, 53-61 (1977). pBR 322 plazmid (Boehringer Ingelheim). A plazmid dezoxi-ribonukleinsavát lizozimmal lizált E. coli sejtekből izoláljuk cézium-klorid-etidium-bromid sűrűségi gradienssel. Gazda mikroorganizmus: E. coli HB 101. A donor mikroorganizmus a Bacillus megaterium, a mikroorganizmus az alábbi mikrobiológiai jellemzőkkel rendelkezik: 1) Morfológia: pálca (0,5—0,7 pX 2,0-5,0 p méretű), mozgó, gratn-pozitív festésű, a spórák terminális vagy szubterminális állásúak. 2) A sejtek Nutrient folyékony táptalajon jól növekszenek. 3) Nutrient-agar: jól növekszik; a telepek a közepükön sűrűek, a telep szélein diffúzak. 4) Tej: a peptonizáció pH-változás nélkül következik be. 5) Zselatin: nem folyósítja el. 6) A nitrátok redukciója: negatív. 7) Kataláz-reakció: negatív. 8) Oxidáz-reakció : negatív. 9) Citokróm-oxidáz-reakció: negatív. 10) Indol-termelés: negatív. 11) Kén-hidrogén termelés: negatív. 12) Szénhidrát-hasznosítás és spektrum: felhasználja az arabinózt, xilózt, galaktózt, glükózt, levulózt, maltózt, raffinózt, szaccharczt, keményítőt, és ezekből savat termel. Nem hasznosítja a ramnózt, mannózt, melibiózt, inulint és szalicint. 13) Poliolok hasznosítása: hasznosítja a szorbltot és a mannitot, ugyanakkor az adenitot, dulcitot és inozitot nem. 14) Dekarboxiláz-reakció lizinnel vizsgálva: negatív. 15) Urcolízis: gyenge. 16) Nehézfém-ionokkal szembeni rezisztencia: 500 rész/millió rész Cr+++ jelenlétében növekszik. 17) Nátrium-kloridot tartalmazó táptalaj: 3,5% nátrium-klorid koncentráció mellett növekszik. 18) A növekedés szempontjából optimális hőmérséklet: 30-37 °C. Növekedés még bekövetkezik: 40—50 °C. Még növekszik: 5 20 °C. 19) Oxigén-igény: aerob. A mikroorganizmust mikrobiológiai tulajdonságai alapján a Bergey’s Manual od Determinative Bacteriology 8. kiadása alapján (Buchanan és Gibbons szerkesztése; Williams és Wilkins Company, Baltimore, Md.) Bacillus megateriumnak határoztuk meg. A mikroorganizmust a National Collection of Industrial Bacteria (NCIB) törzsgyűjteményébe letétbe helyeztük (Torry Research Station, PO Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG. Skócia). A letétbe helyezés 1980. február 12-én történt, törzsünk a törzsgyűjteményben az NCIB 11568 sorszámot kapta. Az alábbiakban ismertetjük az eljárást. A) In vitro rekombináció a lambda és a B. megaterium dezoxi-ribonukleinsava között * 1 2 7 pg B. megaterium dezoxi-ribonukleinsavat hasítunk 10 egység Hind III enzimmel 37 °C hőmérsékleten, egy órán át, 25 pl trisz-puferrel (7,5 pH) készült reakcióelegyben. Ugyanakkor, ugyanezzel az enzimmel 2 pg NM 590 lambda dezoxi-ribonukleinsavat hasítunk. A reakciót úgy állítjuk le, hogy a reakcióelegyet 10 percen át 75 °C hőmérsékleten tartjuk. A hasítás hatékonyságának megállapítására két vizsgálatot végzünk: 1) A két reakcióelegy egy-egy mintáját agaróz gélen 20 órán át 20 V feszültségkülönbséggel elektroforézisnek vetjük alá. A gélt etidium-bromiddal festjük, és megfigyeljük a csíkok helyzetét: a lambda dezoxi-ribonukleirsavból származó két csík a lambda DNS-en egyetlenegy Hind III hasítás eredménye, a bakteriális dezoxiribonukleinsavból származó nagyszámú, majdnem átfedő csíkok pedig nagyszámú hasításra utalnak. i 2) A fág dezoxi-ribonukleinsavának transzfekciós mérése azt jelzi, hogy a hasítás több mint 99%-os hatékonyságú; ily módon a fág dezoxi-ribonukleinsavának biológiai aktivitása majdnem teljesen megszűnik. A hasított dezoxi-ribonukleinsavakat keverjük, és öt órán át 10 °C hőmérsékleten 0,15 egység T4 dezoxirendeződés és kovalens kötések kialakítására az egyes DNS fragmensek között. Az inkubáció végén a dezoxi-ribonukleinsavat in vitro olyan készítménnyel keverjük, amely két komplementer módon defektiv fág lizátumot tartalmaz (Dam-lambda és Eam-lambda), ezeket a fágokat nem szuppresszív törzsekből nyerjük, Hohn, B. és munkatársai, Proc. Nat. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
