195514. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a primicin (triamicin ?) antibiotikum-komplex feltárására
1 195 514 2 kémiai detektálással vagy bioautográfiával kimutathatók. Kémiai detektálásra a már korábban ismert reagensek közül a vanilin-kénsav és a módosított Sakaguchi-reagens bizonyult a legjobbnak, ezek adtak jellemző és érzékeny színreakciót. A kromatografált rétegeket előnyösen a detektáló szerekbe mentve és megszántva hívtuk elő. Vanilin-kénsav-reagens készítése: 0,25 g vanilint (analgrad) 100 ml n-propanol :széntetrak1or,id =1:1 térfogatarányú elcgyében oldunk. Az elegy.ct —15 °C-ra lehűtjük, majd kevergetés közben 2,5 nd tömény kénsavat adagolunk hozzá részletekben. A reagens színtelen, mélyhűtőben 2 hétig tárolható. Előhívás vanilin-kénsav reagenssel: a gondosan szárított vékonyrétcglcmczckct egy, a reagenst tartalmazó kád megdöntésével alámerítjük, a reagens feleslegét lecsurgatjuk, vízszintes helyzetben az oldószert leszikkasztjuk, majd áramló hideg levegővel leszárítjuk. A beíemerítést, a szikkasztást és a szárítást megismételjük, majd a kapott foltokat 2-3 percig 105 °C-on indikáljuk. A komponensek szürkéslila színnel jelentkeznek, rózsaszínű háttérrel. A kromatogramok évekig tárolhatók. A reagens érzékenysége 0,1 pg/folt. Sakaguchi-reakció kivitelezése: I. oldat készítése: 5 g nátriumhidroxidot 10 ml desztillált vízben oldunk hűtés közben, majd 90 ml metanolt adunk hozzá, és szűrjük. Ebben 0,1 g oxint (8-hidroxikinolint oldunk. A reagens jégszekrényben tárolva 1 hétig stabil. II. oldat készítése: 100 ml előre lehűtött 10%-os etanolban 0,5 g N-brómszukcinimjdet szuszpendálunk. A reagens bróm keletkezése kökben lassan oldatba megy. Hűtőszekrényben tárolva 5 napig stájbil. Előhívás: a hűtött I. oldatba merített réteget áramló hideg levegővel citromsárga színűre szárítjuk. Majd a II. oldaton is áthúzva, élénk piros színű foltok jönnek elő. A szárított kromatogram hetekig tárolható. A reagens érzékenysége: 1 /ug/folt. A triamicin antibiotikum-komplex komponenseinek kimutatására bioautográfiával. A VRK-s futtatás és a kémiai előhívás után a lemezt a foltok mentén függőlegesen csíkokra vágjuk. Közben agar-lerpezt öntünk, mely Bacillus subtilis ATCC 6633 tesztorganizmussal van felülfertőzve. A kivágott csíkot az agar-lemezre ráfordítjuk, miután a fonákján megjelöltük a foltokat, vagy a csíkot függőlegesen kettévágjuk és csak az egyik felét fordítjuk rá az agar-lemezre.Ezután 37°C-on 20—24 óráig inkubáljuk az agar-lemezeket. A termosztátból kiemelve, jól láthatók az agar-lemezen a baktérium-gátlás helyei. Ha a teljes csíkot ráfordítottuk, akkor á fonákján megjelölt folt-helyek alapján, ha pedig csak a fél csíkot fordítottuk rá, akkor a másik fél csík melléhelyezése alapján azonosíthatók a baktérium-gátló hatásét felelős foltok. A találmány szerinti VRK-ás eljárás alkalmas a triamicin (primicin) antibiotikum-komplexet alkotó komponensek minőségi, mennyiségi és mjkropreparatív (1—3 mg-os nagyságrendben) elválasztásra, azaz az antibiotikum-komplex feltárására. A kapott bioautogramok megfelelnek a kémiailag detektált összetételnek. Az eredmények egyértelműen igazolják, hogy p triamicin (primicin) antibiotikum egy természetes kompjex, biokémiai egység; mely 3 fő komponens, (major-komponens), úgymint Aj, A3 és Bj, valamint 10 minor komponens, úgymint A2, B2 stb. keveréke. Az antibiotikum szokatlanul rossz oldoldhatósági viszonyaiért az egyes komponensek szerke ,e ti adottságai felelősek, a komponensek ugyanis N - H-*OH közötti hidrogénhíd kötésekkel stabil komple cet képeznek. A különböző eredetű antibiotikuinko' íplex minták vékonyréteg-kromatograinjait vizuálisan értékelve, azt találtuk, hogy a komponensek összegét bében nem mutatnak jelentős különbséget, a mennyiségi adatokban azonban eltérések vannak. A komplex mennyiségi viszonyainak megismerésére a vékonyrétegkromatogramokat dcnzitométcrrel értékeljük ki. A III. oldószer-rendszerben végeztük a futtatásokat, majd kémiai előhívás és egy napi állás után Shimadzu „microcomputer based” denzitométerrel értékeljük ki. A III. oldószerrendszerben végeztük a futtatásokat, majd kémiai előhívás és egy napi állás után Shimadzu „microcomputer based" denzitométerrel értékeltük ki a lemezeket. A „Distance”-értékekből az Ai-főToltra vonatkoztatott relatív Rf értékeket adtuk meg. Az „Area” gépértékekből a kromatogram foltjainak összegére (100%) számítottuk az egyes komponensek mennyiségi adatait. Az összehasonlító vizsgálatot a következő anyagokkal végeztük: 1. A szerkezeti felderítésnél használt „antibiotikumszulfát” (1974). 2. A 83 %-os dimetilformamidból kristályosított termék (1979). 3. Az iparilag előállított „antibiotikum-szulfát” (1982). 4. A 3. mintából anioncserélővei kapott bázis (1982). 5. „Permetilált primicin”, biológiailag inaktív művi termék (trimetil-guanidin, trimetil-karbamid, „Equiv. wt. ca 1467” elnevezésű, nem azonosított Komponens) összehasonlítási alap (1974). A triamicin (primicin)-koniplex VRK-s vizsgálatának eredményeit az 1. ábrán és az 1. táblázatban foglaltuk össze. Az 1. ábra az antibiotikum-komplex vékonyrétegkromatogramját és bioautogramját ábrázolja. A jelölések magyarázata: 1., 2., 3., 4.: a vizsgált minták sorszáma. Aj, A3, B2: az izolált major-komponensek. Rf/A,: az Arkomponcnsrc vonatkoztatott Rpérték. A VRK-s meghatározás paraméterei: kétszeres futtatás III. oldószerrendszerben, előhívás: Vanilin-kénsavas módszerrel. Az I. táblázat a triamicin-komplex vékonyrétegkromatogramjának kiértékelését tartalmazza, az egyes komponensek %-os megoszlásának szempontjából. I. táblázat Triamicin (primicin)-komplex vékonyrétegkromatogramjának kiértékelése az egyes komponensek %-os megoszlásának szempontjából %-os n ícgos/.lás Vizsgált Főkomponensek Minor-komponensek minták A, A3 Bi A2, B2 »........ [100 -(A, + A3 + B,)] 1. 51,7 16,8 12,5 19,0 2. 33,3 30,2 17,6 18,9 3. 40,2 20,2 20,3 19,3 4. 30,3 27,6 14,2 27,9 5. 49,9 18,3 12,9 18,9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
