195514. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a primicin (triamicin ?) antibiotikum-komplex feltárására
1 195 514 2 A találmány tárgyát a triamicin (primicin) antibiotikum-komplex feltárására szolgáló eljárás képezi. A triamicin (primicin) antibiotikum-komplex a Streptomycetae családhoz tartozó Thermopolyspora galeriensis sugárgombafaj tenyészetével állítható elő, makrolid típusú antibiotikum. A makrolid antibiotikumok közül régóta ismert a Thermopolyspora galeriensis fajhoz tartozó törzs által termelt primicin, melynek előállítását elsőként a 146 332 a.sz. magyar szabadalmi leírás ismerteti. Ennél gazdaságosabb eljárást véd a 1.79 148 a.sz. magyar szabadalmi leírás, mely primicin-bázis, illetve ásványi savakkal alkotott sói előállítására vonatkozik. Ismeretes a primicin szerkezete, melyet ozonolízissel kapott úgynevezett secoprymicin lebontási termékből határozlak meg (J. Am. Chcm. Soc. 96, 816-836, 1974). E szerint a primicin kémiailag 18-arabinozil-2-(n-butil)-3,7,11,15,- 19,21,23,25,37-dekahidroxi-4,16,32,34,36-pentametiltetrakonta-l6,32-dién-35-0-lakton-40-guanidiniumszu1fátnak felel meg. Az arabinoz és guanidin egységei egyedülállóvá teszik a makrolid antibiotikumok sorában. A Thermopolyspora galeriensis gombafaj törzsének tenyésztési eljárását a 153 593 a.sz. magyar szabadalmi leírás ismerteti. A szakirodalomból ismert, hogy a primicin vízben rendkívül rosszul oldódik. Középerős bázis (pKb = ll,2), mely ásványi savakkal vizoldható sókat nem ad, erősen poláros oldószerekből kristályosítható (J. Antibiot. 32,. 1207, 1979). Feltárására irányuló papírkromatográfiás kísérletek az úgynevezett „szekunder-adszorpció” jelenségét mutatták. (Nature, 203, 1225, 1965). Az oldhatósági izotermák és a szerkezetkutatásnál előállított primicin-aminosav N-acetil metilészterénck lömcgspCktrumában talált molckula-ioncsiics arra utalt, hogy a primicin mellett még egyéb komponensek is jelen vannak. (J. Am. Chem. Soc. 96, 816-836, 1974). A más nrakrolid-antibiotikumoknál már bevált vékonyréteg-kromatográfiás kísérletek néni voltak célravezetőek a feltételezett komponensek szétválasztására (J. Chromatography, 193, 119, 1980). Célul tííztük ki, hogy a Thermopolyspora galeriensis gombafaj MNG 00181 törzse által termelt antibiotikumkomplex feltárására eljárást dolgozzunk ki. A triamicin (primicin) antibiotikum-komplexet a fizikai-kémiai adatokon kívül a vékonyréteg-kromatográfiás (a továbbiakban: VRK) összetételével, 13C-NMR-spektrumával, továbbá a polirezisztcns bumánpatogén mikroorganizmusokra gyakorolt antibiotikus hatás-spektrumával jellemezzük, ami a gyakorlati alkalmazhatóságának alapját képezi. A triamicin (primicin) antibiotikum-komplex feltárására irányuló eljárás kidolgozása során meglepő módon azt találtuk, hogy az együttesen oldódó és kristályosodó antibiotikum-komplex, mely neutrális oldószer-rendszerekkel futtatva az úgynevezett „szekunder adszorpció” jelenségét mutatja, erősen asszociábilis oldószerrendszerekkel és ismételten futtatva komponenseire szétválasztható, a szétválasztott komponensek pedig mind bioautográfiával, mind kémiai detektálással kimutathatók. A triamicin (primicin) antibiotikum-komplexből gyógyászati készítményeket állítanak elő, melyek állandó biológiai hatékonysággal kell, hogy rendelkezzenek. Ezért igen előnyös összetételű primicin-komplexből, ha a változó az egyes állandó összetételű komponensek egymástól szétválaszthatok, és megfelelő arányban a 2 fermentációban megkapott antibiotikum-komplexhez keverve a kívánt biológiai hatékonyság beállítható. A találmányunk szerint úgy járunk el, hogy a Thermopolyspora galeriensis sugárgombafaj MNG 00181 törzsének micéliumából származó zsírmentes nyers-, félkészvagy késztermékek törzsoldatát VRK-san többszörösen futtatjuk, majd a kapott foltokat indikáljuk, és az antibiotikum-komplexet major- és minor-komponensekre szétválasztjuk. A fermentléből kinyert nyers-, félkész- vagy késztermékek törzsoldatának elkészítéséhez 1—4 szénatomos alkoholoknak vagy azok keverékének vizes elegyét, előnyösen etanol : n-butanol : víz = 25 :25 :50 térfogatarányú elegyét alkalmazzuk, melegen. A fenti oldószcrelcggyel 0,5 1,0 vegyes%-os oldatot készítünk, és ebből 50-200 jug mennyiséget viszünk fel egy-egy startpontra, előnyösen csíkban. A vékonyréteg-kromatográfiás futtatáshoz hordozóként Kiesel-gélt alkalmazunk. A vékonyréteg-kromatográfiás futtatáshoz kombinált oldószer-rendszert alkalmazunk, mely 1—4 szénatomos szerves savat és/vagy klórozott szénhidrogént és/vagy 1—4 szénatomos alifás alkoholt és/vagy vizet tartalmaz. Kísérleteink során a megfelelő oldószerrendszer megtalálása céljából több mint 250 oldószerrendszer részletes VRK-ás vizsgálatát végeztük el. Úgy találtuk, hogy a már korábban ismert „szekunder adszorpció” jelensége megakadályozható, ha a korábban alkalmazott neutrális oldószerrendszerek helyett erősen asszociábilis oldószerrendszereket használunk. Alkalmas oldószernek bizonyultak az 1—4 szénatomos szervessavak, mint például hangyasav, ecetsav, tejsav, a klórozott szénhidrogének, mint például kloroform, az 1—4 szénatomos alifás alkoholok, mint például metanol, etanol, n-butanol, a bázisok, a formamid stb., illetve ezek víztartalmú elegye. A triamicin antibiotikumkomplexre nézve leginkább szelektív futtatóknak a következő oldószerrendszerek adódtak: — I. n-butanol : jégecet : víz = 60:10 :30 térfogatarányú elegyének felső fázisa, — II. n-bulano! : metanol :jégecct :víz = = 75:2:8:15 térfogatarányú elegye, — III. kloroform .’metanol : hangyasav :víz = = 50:35:14:1 térfogatarányú elegye, — IV. kloroform : metanol : jégecet :víz = = 45:30:15:20 térfogalarányú elegyének alsó fázisa. Az I. és II. futtatórendszerek nagyobb kapacitásúak, a III. és IV. rendszerek viszont szelektívebbek és előnyösen rövidebb a futtatási idejük, ami üzemi sorozatvizsgálatoknál nem elhanyagolható tényező. A III. futtatórendszer metilformiát-észter keletkezése miatt kémiailag, a IV. oldószer-rendszer fizikailag metastabil állapotban van. A III. rendszer izotermája alapján az elkészítésétől számított 16—24 óra hosszáig használható, a IV. rendszerhez 1—2% metanolt adva, 1 hétig stabilan eltartható. Legelőnyösebben a III. oldószerrendszer alkalmazható. A triamicin (primicin) antibiotikum-komplex egyes komponenseinek igen közeli Rf-ériékei miatt előnyösnek bizonyult kétszer, azaz nyújtva futtatni, közben oldószermentesre szárítva a lemezeket. (Például a komponensek közül az A^j és az A3 egy foltban jelentkezik, Rf értékük = 0,05). Az ismételt futtatással összetevőire szétválasztott triamicin (primicin) antibiotikum-komplex komponensei 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
