195475. lajstromszámú szabadalom • Eljárás farmakológiailag aktív helyettesített benzamidok és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
7 195 475 8 tésével jelentkezik, s az agykéreg ingerelheti a nyúltagyban levő hányásközpontot. Jelenleg több gyógyszer is rendelkezésre áll a hányás megakadályozására, így a nretoklopramid, bromoprid, alizaprid, kleboprid, domperidon és nabilon. A legfontosabb közülük a metoklopramid, amelyet kiterjedten alkalmaznak a ciszplatinnal együtt; ez utóbbi hatékony, azonban rendkívül emetogén kemoterápiás szer. A jelenleg rendelkezésre álló, helyettesített benzantid alapú antiemetikumok általában dopaminerg antagonisták, és feltételezik, hogy a hányásellenes hatásukat a CTZ-ben levő dopamin receptorok blokkolásával fejtik ki. A lehetséges antiemetikumok farmakológiái szűrővizsgálatához a gyakorlatban olyan teszteket alkalmaznak, amelyekkel a dopaminerg antagonista aktivitást határozzák meg — ilyen például az in vitro spiperon-megkötő vizsgálat —, valamint az apomorfinnal kiváltott hányás csökkenését vizsgálják kutyán vagy macskán. Az ismert, helyettesített benzamid alapú antiemetikumok főbb mellékhatásai a dopaminblokkoló hatásukból erednek, és a következők tartoznak ide: akatizia, heveny disztonia, Parkinson-kór jellemzői és késleltetett mozgászavar, gyakran idegrendszeri depresszióval együtt. Az új (I) általános képletű vegyületek hatékony antiemetikumok, azonban nem dopaminerg antagonisták, amint azt mind az in vitro vizsgálatok (spiperon-megkötés), mind az in vivo vizsgálatok (apomorfinnal kiváltott hányás kutyán) mutatják. Az (I) általános képletű vegyületek tehát jó antiemetikus aktivitással rendelkeznek (különösen kemoterápiás kezeléssel kiváltott hányással szemben), a hatásuk igen specifikus, nem jelentkeznek azonban azok a fentebb ismertetett mellékhatások, amelyek a dopaminerg antagonista helyettesített benzamidoknál tapasztalhatók. A kereskedelmi forgalomban levő, helyettesített benzamid alapú antiemetikumok közül igen sok vegyület, például a metoklopramid, gasztrokinetikus aktivitással is rendelkezik, s ennélfogva felhasználható a csökkent mértékű gyomor-bél mozgással kapcsolatos rendellenességek, így a késleltetett gyomorkiürülés, emésztési zavar, haspuffadás, nyelőcsövi reflux stb. kezelésére. Kimutattuk, hogy némelyik (I) általános képletű vegyület hasonló aktivitással rendelkezik mint a metoklopramid az ingerelt tengerimalac-ileum teszten (2. táblázat), amely a gasztrokinetikus aktivitás egyik elfogadott vizsgálati módszere. Tekintette] arra, hogy az (I) általános képletű vegyületek nem dopaminerg antagonisták, nem rendelkeznek azokkal a fentebb említett mellékhatásokkal, amelyek megtalálhatók az ismert helyettesített benzamidoknál, például a metoklopramidnál vagy' a klebopridnél. Biológiai vizsgálatok A) 3H-Spiperon kiszorítása Ez a vizsgálat azoknak a vegyületeknek a kiválasztására szolgál, amelyek képesek a radioaktív spiperon ligandum kiszorítására in vitro, homogenizált patkányagy korpusz striatum alkalmazásával. A vizsgálatot azoknak a vegyületeknek az azonosítására alkalmazzák, amelyek affinitással rendelkeznek a dopaminerg (D2) receptorokhoz. 150 ± 10 g testtömegű patkányok (Charles River) fejét levágtuk, kimetszettük a korpusz striatumot és szárazjéggel megfagyasztottuk. A szöveteket elegyítettük és a felhasználásig —80 °C-on tároltuk. Hideg HEPES.KOH pufferben (végső pH =7,4) homogenizáltuk (Brinkmann Polytron) a korpusz striatumot, majd centrifugáltuk 39.000 x G értéken. A felülúszó folyadékot elöntöttük, a szemcséket pedig ismét HEPES. KOH pufferben szuszpendáltuk és a fenti módon újból centrifugáltuk. A felülúszó folyadékot ismét elöntöttük, és a szemcséket az alábbi összetételű pufferoldatban szuszpendáltuk: 50 mM HEPES.KOH, 0,1 vegyes % aszkorbinsav, 10 (pM pargilin, 120 mM nátriumklorid, 5 mM káliumklorid, 2 mM kalciumklorid és 1 mM magnéziumklorid. A pufferoldat pH-értéke 7,4 volt. A szuszpendálást 20 °C-on végeztük, és 1 g nedves szövetszemcsét 100 ml pufferoldatban szuszpendáltuk. A következőképpen határoztuk meg az (I) általános képletű vegyületek és az összehasonlító vegyületek 50%-os gátló koncentrációját (IC50) 3 H-spiperonnal szemben. Kémcsövekbe vagy 100 pl pufferoldatot mértünk be (a teljes megkötéshez), vagy 100 pl pufferoldatot és 100 pl 10^ M koncentrációjú ’D/+/-butaklamolt (vakpróbákhoz, azaz nem-specifikus megkötéshez), vagy 100 pl pufferoldatot mértünk be, amely utóbbi 10'7, 10'6 vagy 10"5 M koncentrációban tartalmazta a vizsgálandó vegyületet. Mindegyik kémcső tartalmához 100 pl 3H-spiperon-oldatot adtunk (gyártó: New England Nuclear), amely pufferoldattal készült (2000 c.p.m. aktivitású az inkubáló elegyben), továbbá 800 pl korpusz striatum szövetszuszpenziót adtunk a kémcsövekhez, amelyek tartalmát azután 1 ml pufferoldattal hígítottuk, fgy a végső koncentráció 10’8, 10’7 vagy 10'6 M vizsgálandó vegyület és közelítőleg 100 pM 3 H-spiperon volt. A mintákat 15 percig inkubáltuk 37 °C-on, üvegszálas szűrőn szűrtük vákuum alkalmazásával, és folyadékszcintillációs spektrometriával mértük az aktivitást. Ahol a vizsgált vegyületeknél annak legnagyobb koncentrációjában (10~6 pM = 1000 nM) nem értük el az IC5 o-értéket, a 2. táblázatban az eredményeket mint >1000 nM adjuk meg. Az összehasonlító vegyületeknél, ahol az IC50 -értéket elértük vagy túlléptük az eredeti koncentrációkkal, megismételtük a vizsgálatokat annak a koncentrációnak az 1/4, 1/2, 1, 2 és 4-szeres értékével, amelyről feltételeztük, hogy a legközelebb áll az ICso-értékhez, úgy, hogy pontosabban meg tudjuk határozni az ICj 0 -értéket. Ezeket az utóbbi eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg. Valamennyi mintával párhuzamos vizsgálatokat végeztünk. B) Az apomorfinnal kiváltott hányás gátlása kutyákon A vizsgálatokhoz mindkét nemű vadászkopókat használtunk, előzetes koplaltatás nélkül. A vizsgálandó vegyületeket és az apomorfint szubkután adtuk be az állatoknak vizes oldatban, ahol a vizsgálandó vegyületek beadása 30 perccel megelőzte az apomorfin beadását. Az apomorfin beadása után 60 percig figyeltük, hogy bekövetkezett-e a kutyáknál a hányás vagy a vegyületek tökéletesen megvédték-e attól őket. Az apomorfint 0,3 mg/kg dózisban adtuk be. Mivel a vizsgált új vegyületeknél gyakorlatilag nem volt tapasztalható apomorfinnal szembeni antagonizmus, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
