195252. lajstromszámú szabadalom • Eljárás apramicint, 6"-O-karbamoil-tobramicint és 6"-O-karbamoil- kanamicin B-t tartalmazó fermentlevek előállítására, mikrobiológiai úton
195252 4 hozzá. 24 órán át folytattuk a tenyésztést, majd megfelelő hígítást követően a tenyészetek egy részét agarlemezekre szélesztettük, másik részével pedig azonos mennyiségű etidium-bromidot tartalmazó folyékony halmazállapotú táptalajokat oltottunk. Ezeket 24 órán át ismét tenyésztettük, majd fentiek szerint megismételtük a szélesztést és a továbboltást. Az új folyékony halmazállapotú tenyészeteket 24 óra múlva ismét szélesztettük. Az agarlemezeket inkubáltuk, majd több különálló telepet izoláltunk és termelőképességüket a példában ismertetett módon vizsgáltuk. A Streptomyces tenebrarius MNG 169-ből származó több száz vizsgált izolátum közül két törzs nebramicin-2-t nem, nebramicin-4-et nyomokban, nebramicin-5’-t pedig viszonylag kis mennyiségben termelt. A nebramicin-5’-t termelő két törzs termelőképességének fokozására törzsnemesítési és táptalajoptimalizálási kísérleteket végeztünk. Ezek során az egyik elpusztult, a másik termelőképessége viszont többszörösére fokozódott és ezt a szintet stabilan megtartotta. A törzset letétbe helyeztük az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti Törzsgyűjteményében, ahol az MNG 204 deponálási számot kapta. A találmány alapja az a felismerés, hogy a Streptomyces tenebrarius MNG 169-deponálási számú törzs és a fentiek szerint előállított új, nebramicin-2-t nem termelő Streptomyces tenebrarius MNG 204 deponálási számú törzs spóráit vagy vegetatív micéliumait megfelelő arányban keverve, majd együtt tenyésztve, nebramicin-2-t és nebramicin-5’-t előre meghatározott arányban tartalmazó fermentlevek állíthatók elő. A kevert fermentáció során a két törzs, meglepő módon több antibiotikumot termel, mint külön-külön tenyésztve. Több antibiotikum komponenst bioszintetizáló mikroorganizmus törzsek által termelt egyes antibiotikumok arányának kevert fermentációval való szabályozása mind ezidáig ismeretlen a fermentáció technikában. Fentiek alapján a találmány tárgya eljárás előre meghatározott összetételű, 0,5— 77% nebramicin-2-bői, 2,7—8,6% nebramicin-4-ből és 20—95% nebramicin-5’-ből álló antibiotikum keveréket tartalmazó fermentlevek előállítására mikrobiológiai úton, amely abban áll, hogy az új Streptomyces tenebrarius MNG 204 deponálási számú törzs és a Streptomyces tenebrarius MNG 169 sorszámú törzs, vagy ezen törzsek mutánsai (100:1) — (1:100) arányban kevert spóráit vagy vegetativ micéliumait szerves szén- és nitrogénforrást, szervetlen sókat, nyomelemeket, állati és/vagy növényi eredetű olajokat és/vagy zsírokat tartalmazó táptalajon süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között, 33 és 40°C közötti hőmérsékleten, előnyösen 37°C-on tenyésztjük. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint úgy járunk el, 3 hogy az MNG 169 deponálási számú Streptomyces tenebrarius és az MNG 204 deponálási számú Streptomyces tenebrarius törzs vagy azok valamely mutánsa spóráit vagy vegetatív micéliumait a kívánt antibiotikum összetételnek megfelelő arányban keverjük, majd együtt tenyésztjük. A felhalmozódott antibiotikumokat ismert módon, előnyösen a 174 315 sorszámú magyar szabadalmi leírás szerint különítjük el. A termelt nebramicin-2 és a bioszintetizált nebramicin-5’ mennyisége közel arányos az azonos növekedési fázisban lévő összekevert MNG 169 és MNG 204 sejtek arányával. A témában jártas szakember előtt nyilvánvaló, hogy a fentiek olyan fermentációs rendszerben érvényesek, ahol a kevert sejtek közel azonos sebességgel osztódnak, és ahol a fermentációs rendszer paraméterei egyaránt kedveznek mindkét komponens bioszintézisének. Egyébként az arány eltolódhat. Az előnyös keverési arány beállítása szakember számára nem jelent nehézséget. A találmány szerint a mikrorganizmusok tenyésztését szerves szénforrást, például keményítőt, glicerint, fruktózt vagy más hasonló vegyületeket, előnyösen glükózt; szerves nitrogénforrást, például mogyorólisztet, kukoricalekvárt, peptont, élesztőkivonatot vagy más hasonló készítményeket, előnyösen szójalisztet, kazeint, aminosavakat, előnyösen glutaminsavat; szervetlen nitrogénforrást, előnyösen ammónium-kloridot, ammónium-nitrátot és ammónium-szuifátot; szervetlen sókat, előnyösen magnézium-szulfátot, cink-szulfátot, kobalt-nitrátot és kalcium-karbonátot; állati és/vagy növényi zsírokat és/vagy olajokat, például pálmaolajat, lenolajat, napraforgóolajat, repceolajat, disznózsírt vagy másokat, előnyösen pálmaolaj és lenolaj 1:1 arányú elegyét, és a mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez elengedhetetlenül szükséges nyomelemeket tartalmazó táptalajon süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között a mikroorganizmus növekedését biztosító, előnyösen 33°C és 40°C közötti hőmérsékleten addig végezzük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum nem halmozódik fel. Az antibiotikumokat ismert módon különítjük el. A nyomelemeket az egyéb táptalajösszetevők általában szenynyezőanyagként tartalmazzák, de külön is hozzáadhatjuk a táptalajhoz. Az átáramoltatott levegő mennyiségét a táptalaj összetétele, a keverő hatásfoka és a fermentor műszaki adatai alapján kell megválasztani. Általában előnyös, ha a sejtek oxigénellátását úgy állítjuk be, hogy az elmenő gázelegy C02-tartalma ne emelkedjen 1,0% fölé és a táptalajból a redukáló cukor a 96. és a 110. óra között fogyjon el. A táptalajok sterilezését 30-60 percen ál 121 — 123°C hőmérsékleten gőzzel végezzük. A táptalajok pH-ját sterilezés előtt 7,2-7,4 közötti értékre célszerű beállítani. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
