195252. lajstromszámú szabadalom • Eljárás apramicint, 6"-O-karbamoil-tobramicint és 6"-O-karbamoil- kanamicin B-t tartalmazó fermentlevek előállítására, mikrobiológiai úton
195252 A fermentáció közben habzásgátlót nem kell adagolnunk, mivel a tápanyagforrásként adagolt növényi vagy állati zsírok vagy olajok egyúttal a tenyészet habzását is gátolják. A tenyésztés történhet rázott lombikban, laboritóriumi, kísérleti üzemi vagy üzemi íermentorokban. A tenyészetek antibiotikum komponensösszetételét szilikagél vékonyréteg-kromatográfiát követően, bioautográfiával határozzuk meg. A szilikagél (Merck, Darmstadt) vékonyrétegre 0,1-0,5 pg/ml közötti mennyiségű antibiotikumot cseppentünk, majd futtatóelegyként etil-alkohol, metil-etil-keton és 25%os ammónium-hidroxid 1:1:1 arányú elegyét használva kromatografálunk. (R; nebramicin-2:0,18; R, nebramicin-4:0,30; R, nebramicin-5’:0,42) A gél teljes száradása után Bacillus subtilis ATCC 6633 mikroorganizmust tartalmazó táptalajt rétegezünk a lemez felületére és 37°C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk. Ezután standarddal összehasonlítva meghatározzuk a gátlási zónák nagyságát. A mérés mennyiségi és minőségi kiértékelésre alkalmas, pontossága ±10%. (Kádár Pauncz J. és Harsányi I., J.Chrom. 195, 251 (1980)). A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: A két különböző törzs sejtjeinek keverésével és együttes tenyésztésével a nebramicin-2-t és a nebramicin-5’-t a mindenkori piaci igényeknek, árviszonyoknak stb. megfelelő, előre elhatározott mennyiségben tartalmazó fermentleveket állíthatunk elő. Külön előny, hogy a kevert fermentáció során a két törzs nem veszti el termelési kapacitásának jelentős részét, sőt összességében több antibiotikum bioszintetizálódik. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbiakban kiviteli példával részletesen szemléltetjük. Példa Nebramicin-2-t és nebramicin-5’-t előre meghatározott arányban tartalmazó fermentlevek előállítása. Streptomyces tenebrarius MNG 204 és Streptomyces tenebrarius MNG 169 deponálási számú törzsek spóráival vagy vegetatív tenyészetével külön-külön az alábbi összetételű, desztillált vízzel készült ferdeagarokat oltjuk: dextrin 1,0 % élesztőkivonat 0,1 % kazein-hidrolizátum (10%-os)* 2,0 % húskivonat 0,1 % kobalt-diklorid-hexahidrát 0,001 % agar 2,5 % *enzimatikusan hidrolizált A táptalaj pH-ját sterilezés előtt vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be, majd 121 °C hőmérsékleten 20 percen át sterilezzük. 5 4 Négy napon át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd a táptalaj felületéről steril desztillált vízzel leválasztjuk a spórákat és a micéliumokat, és az így kapott Str. tenebrarius MNG 204 és Str. tenebrarius 169 sejtszuszpenziókkal 10x100 ml, 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban sterilezett alábbi összetételű, csapvízzel készült inokulum táptalajt oltunk külön-külön: szójaliszt 2,0 % kazein-hidrolizátum (10%-os)* 3,0 ammónium-nitrát 0,1 % ammónium-klorid 0,3 % kalcium-karbonát 0,3 % magnézium-szulfát-heptahidrát 0,5 % pálmaolaj és lenolaj 1:1 arányú elegye 3,0 % glükóz (külön, 50%-os oldatként sterilezve) 2,0 % *enzimatikusan hidrolizált A táptalaj pH-ját vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be, majd 121 °C hőmérsékleten 20 percen át autoklávban sterílezzük. A beoltott tenyészeteket 14-18 órán át 2,4 cm átmérőjű kör mentén percenként 280-at forduló síkrázógépen 37°C hőmérsékleten tenyésztjük. Az így előállított érett inokulumokkal külön-külön, illetve azok alábbiakban megadott arányú keverését követően, 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100 ml térfogatú és 10 I hasznos térfogatú laboratóriumi fermentorban 121°C hőmérsékleten 45 percen át sterilezett, 5 1 térfogatú, csapvízzel készült alábbi összetételű főfermentációs táptalajokat oltunk, az oltáshoz 1 tf. % inokulumot alkalmazva: 6 szójaliszt 3,0 % kazein-hidrolizátum (10%-os)* 5,0% ammónium-nitrát 0,1 % ammónium-klorid 0,5 % L-glutaminsav 0,8 % kalcium-karbonát 0,5 % magnézium-szulfátheptahidrát 0,5 % koba It-dinitrát-hexahidrát 0,001% pálmaolaj és lenolaj 1:1 arányú elegye 3,0 % glükóz (külön, 50%-os oldatként sterilezve) 4,2 % *enzimatikusan hidrolizált A táptalaj pEUját sterilezés előtt vizes ammónium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be. A tenyésztést 144 órán át 37°C hőmérsékleten végezzük. A fermentor keverőjének fordulatszámát 360/perc-re állítjuk be. A táptalajon percenként 3 I steril levegőt vezetünk át. (A rázott tenyészeteket az előbbiekben ismertetett körülmények között, síkrázógépen növesztjük). A tenyésztés 144. órájában vékonyréteg- kromatográfiát követő biológiai 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
