195250. lajstromszámú szabadalom • Eljárás triciklusos makrolidok előállítására
195250 dékot újra kromatografáljuk szilikagélen, sárga olajat kapva. Az olajos maradékot kétszeres tömegmennyiségíí savas szilikagéllen keverjük össze, a keverékből etil-acetáttal pépet készítünk. Az oldószert elpárolva, száraz port kapunk, amit 100 ml savas szilikagélből n-hexánban készült oszlopra viszünk és ugyancsak n-hexánnal eluálunk. A kívánt anyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson bepároljuk, 380 mg FR-900525 vegyülethez jutva. A sárgás port 5 ml n-hexán/etil-acetát 1:2 (téri.) elegyben oldjuk, és ugyanebben az oldószerelegyben 100 ml savas szilikagélből (speciális szilikagél-922; Fuji Devison Co. készítmény) készült oszlopra visszük. Az eluálást etil-acetáttal végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk, 230 mg tisztított FR-900525 vegyületet nyerve fehér por alakjában. 4. példa A Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushirrtaensis 7238 törzs izolálásakor kb. 1 g Yakushimanál — Kagoshima prefektűra, Japán — gyűjtött talajmintát steril vízzel 5 ml össztérfogatra töltöttünk fel. A keveréket 10 másodpercig keverjük, majd 10 percig állni hagytuk. A felüluszóból hígítási sort készítettünk, az egyes fokozatok közt 100- szoros hígítást alkalmazva. A hígított felü 1 - úszóból 0,1 ml-t tiamin-hidrokloriddal kiegészített Czapek agaron (30 g szacharóz, 3 g nátrium-nitrát, 1 g dikálium-hidrogén-foszfát, 0,5 g magnézium-szulfát, 0,5 g kálium-kiorid. 0,01 g vas(II)-szulfát, 0,1 g tiamin-hidroklorid, 20 g agar, 1000 ml csapvíz, pH=7,2) szélesztetünk Petri csészében. A 21 napos 30°C hőmérsékleten történő tenyésztés után a telepeket ferde agarra vittük (élesztő- és malátakivonatos agar, ISP-2), és 30°C hőmérsékleten tenyésztettünk ki 10 napon keresztül. Az izolált telepek között találtuk a Streptomyces hygroscopicus subsp. yukashimaensis 7238 törzset. 500 ml-es Erlenmeyer lombikok mendegyikébe 160 ml alábbi összetételű táptalaj! öntünk: 1% glicerin, 1% oldaható keményítő, 0,5% glükóz, 0,5% gyapotmagliszt, 0,5% szárított élesztő, 0,5% kukoricalekvár és 0,2% kálcium-karbonát; pH=6,5 értékre beállítva. A táptalajokat 120°C hőmérsékleten 30 percen át sterilezzük. Az egyes lombikokat kacsnyi Streptomyces hygroscopicus szubsp. yakushimaensis .7238 tenyészettel beoltjuk és körkörös rázógépen 30°C hőmérskéleten tenyésztjük 4 napon át. 20 lombik tenyészetével 150 liter alábbi összetételű táptalajt oltunk be: 4,5% glükóz, 1% kukoricalekvár, 1 szárított élesztő, 1 % sikérliszt, 0,5% búzacsíra, 0,1% kálcium-karbonát 0,1% Adekanol (habzásgátló, Asahi Denka Co. készítmény). A táptalajt 200 literes fermentorban sterilezzük 120°C hőmérsékleten 20 percen át. A fermentációt 30°C hőmérsékleten végezzük 4 napon keresztül. A tenyészlevet percen35 ként 250-es fordulatszámmal kevertetjük, 150 liter/perc levegőztetés mellett. A kapott fermentlevet 5 kg diatómafölddel leszűrjük, a kiszűrt micéliumot 50 liter acetonnal extraháljuk. Az 50 liter acetonos extraktumot a fermentlé szűrésekor kapott 135 liter szűrlettel egyesítjük, és 10 liter, nem ionos Diaion HP-20 (Mitsubshi Chemical Industies Ltd.) adszorbens gyantábó.l készült oszlopon engedjük át. 30 liter vízzel és 30 liter acetonnal való mosás után, az oszlopot acetonnal eluáljuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson 2 liter vizes maradékig pároljuk. A vizes maradékot 4 liter etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumot csökkentett nyomáson olajos maradékig pároljuk. A maradékot kétszeres tömegmennyiségű savas szilikagéllel )speciális szilikagél-12, Fuji Devison Co. készítmény) keverjük el, és a keverékből etil-acetáttal pépet készítünk. Az oldószert elpárolva, száraz port kapunk, amit 800 ml azonos savas szilikagélből n-hexánban készült oszlopra viszünk. Az oszlopot 3 liter n-hexánnal, 3-liter n-hexán/ /etil-acetát 4:1 (térf.) eleggyel és 3 liter etil-acetáttal fejlesztjük ki. Az FR-900520 és az FR-900523 vegyületet tartalmazó frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson olajos maradékig pároljuk. A maradékot n-hexán/ /etil-acetát 1:1 (térf.) elegyben oldjuk, és 1000 ml szilikagélből (Merck, szita lyukbőség: 0,200—0,070 mm) azonos oldószerelegyben készült oszlopra visszük. A kromatografálást 3 liter n-hexán/etil-acetát 1:1,3 liter n-hexán/ /etil-acetát 1:2 (térf.) eleggyel és 3 liter etil-acetáttal végezzük. A kívánt anyagokat tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk, 4,5 g sárgás port nyerve. A port 20 ml metanolban oldjuk és az oldathoz 10 ml vizet keverünk. Az oldatot 500 ml fordított fázisú „YMC“ gélből (60— 200 mesh, Yamamura Chemical Institute) metanol/víz 4:1 (térf.) elegyében készült oszlopon kromatografáljuk. Az FR-900520 vegyületet tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk, 1,8 g nyers FR-900520 terméket nyerünk sárgás por alakjában. A port kis menynyiségű dietil-éterben oldjuk. Miután egy éjszakán állni hagytuk, a kivált kristályokat szűréssel összegyűjtjük, dietil-éterrel mossuk, majd csökkentett nyomáson szárítjuk. Dietiléterben átkristályosítva az anyagot, 600 mg tisztított FR-900520 vegyületet kapunk színtelen lapok alakjában. A fordított fázisú szilikagélen való kromatografálást ugyanezzel az oldószerrendszer- Pel végezzük, és az FR-900523 vegyületet tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk 0,51 g nyers FR-900523 terméket nyerve sárgás por alakjában. A nyersterméket 3 ml acetonitrilben oldjuk és az oldatot 70 ml, fordított fázisú „YMC“ szilikagélből acetonitril (tetrahidrofurán) 50 mM foszfát puffer (pH= 2,0) 3:2:5 (térf.) elegyben készült oszlopra visszük és ugyan-36 19 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
