195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
195248 dául az RSF1010, a PUB110 és az SLP1.2 replikonok előnyösek sorrendben a Pseudomonas, Bacillus és Streptomyces esetén, míg a többi fent megadott replikon az E. coli sejtek esetén előnyös. A találmány szerinti vektorok igen változatosak, és funkcionálnak gyakorlatilag bármely prokariota vagy eukariota gazdasejtben. A feltételek a következők: 1) a gazdasejt osztódjon és tenyészthető legyen; 2) a gazdasejt alkalmas legyen transzformációra; 3) a nem transzformált gazdasejt érzékeny legyen és így elpusztuljon a higromicin B és a G418 antibiotikumok közül az egyikre, vagy mindkettőre. Ily módon a találmány szerinti vektorokat használhatjuk baktériumok, gombák, élesztők, növényi sejtek, állati sejtek és szabadon élő egysejtű eukarioták esetén. Az.E. coli K12 sejtekről sok genetikai és biokémiai információ áll rendelkezésünkre, így ezeket előnyösen használhatjuk fel a találmány szerinti-eljárás prokariota gazdasejtjeként. Más, előnyös prokariota gazdasejtként baktériumokat, köztük, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, a következőket használhatjuk: E. coli, E. coli K12 BE 827, Bacillus, Bacillus subtiiis, Pseudomonas, Agrobacterium, Streptomyces, Staphylococcus, Streptococcus, Actinomycètes és Serratia; használhatunk továbbá zöld algákat is. Eukariota gazdasejtként előnyösen gombát, köztük, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, Neurosporá-t, Cephalosporium-ot, Aspergill us-t, Penicillium-ot és élesztőt használunk;használhatunk továbbá tenyészthető, többsejtű organizmusból származó szövetből kapott sejteket, például, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, emlős sejtet, egérsejtet, Mouse Ltk- sejtet, emberi sejtet, madár sejtet, kétéltű állatból származó sejtet, hüllősejtet, a Chordata törzsből származó sejtet, állati sejtet, növényi sejtet, gymnospermous sejtet, angiospermous sejtet; felhasználhatunk továbbá szabadon élő, egysejtű organizmust, például, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, algát és protozoát. Ahogy azt az előzőekben megadtuk, a találmány szerinti vektorok gyakorlatilag bármely prokariota vagy eukariota gazdasejtben funkcionálnak, és hordozzák a higromicin B és a G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát, például az alábbi sejtekben: E. coli K12 BE827, E. coli K12 BE783, E. coli K12 BE 1041, Mouse Ltk- sejtek és Saccharomyces cerevisiae sejtek. így a találmány szerinti transzformánsok, például, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, az E. coli K12 BE827/pKC2l4, az E. coli K12 BE827/pKC2l5, a Mouse Ltk“/pKC214, a Mouse Ltk-/ /pKC215, az E. coli K12 BE783/pKC273 és a Saccharomyces cerevisiae/pKC273 rezisztens a fenti két antibiotikum egyikével vagy mind9 6 kettővel szemben, és így megfelelő szelekciós körülmények között alkalmasak a találmány szerinti vektorok szaporítására és fenntartására. A témában jártas szakember előtt nyilvánvaló, hogy nem szelektálható strukturgének klónozhatok a vektorokba, és így, transzformációt és higromicin B vagy G418 antibiotikumokkal való szelekciós tenyésztést követően emlős vagy más gazdasejtekben a klónozott gének stabilizálhatok, fenntarthatok és kifejezhetők. Csak azok a transzformált gazdasejtek képesek élni, higromicin B vagy G418 jelenlétében, így a találmány szerinti vektorokkal könnyen izolálhatok és azonosíthatók a transzformánsok. Igen jelentős az a tény, hogy a találmány szerinti vektorokkal nagyszámú gazdasejt transzformálható, mivel így lehetővé válik eukariota vektorok könnyű sokszorosítása és az ezekkel való tevékenység prokariota gazdasejtekben. Ez azért előnyős különösen, mivel a prokariotát, például az E. coli és, más, hasonló sejtek genetikai háttere jói ismert, és a hagyományos rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiák ezekben a rendszerekben könnyen kivitelezhetők. A találmány szerinti rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok, köztük a szelektálható vagy nem szelektálható strukturgéneket tartalmazók, először prokariota sejtekben kezelhetők és sokszorosíthatók, majd ezt követően kifejezésre eukariota gazdasejtbe transzformálhatok, ezzel elkerüljük az eukariota rendszerekkel együttjáró nehézségeket. Bár a találmány szerinti eljárás összes kivitelezési változatát használhatjuk, egyes rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kiónozó vektorok és transzformánsok előnyösebbek. Előnyös vektorok a következők: pKC214 plazmidok, pKC215 és pKC273 plazmidok; az előnyös prokariota transzformánsok a következők: E. coli K12 BE827/pKC214, E. coli K12 BE827/pKC215, és E. coli K12 BE783/ /pKC273; az előnyös eukariota transzformánsok a következők: Mouse Ltk~/pKC215, Mouse Ltk~/pKC2i4 és a Saccharomyces cerevisiae/pKC273. A találmány szerinti vektorok és transzformánsok széles körben használhatók fel, és lehetővé teszik a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológia eukariota rendszerekben való gyorsabb és szélesebb körű kivitelezését. Például a találmány szerinti vektorok, köztük: plazmidok, bakteriofágok és vírusok, olyan antibiotikumokkal szemben hordoznak rezisztenciát, amelyek mind eukariota, mind prokariota sejtekre nézve toxikusak, és így lehetővé válik a transzformánsok szelekciója. Ez azért fontos, mivel ilyen vizsgálattal képesek vagyunk meghatározni és kiválasztani azokat az egyes sejteket, amelyek tartalmazzák a vektor dezoxi-ribonukleinsavat. A találmány szerinti vektorokba további, funkcionális kimutatásra alkalmatlan dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat is beépíthetünk, 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
