195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
195248 12 majd ezeket tarnszformálva elkülöníthetjük a nem szelektálható dezoxi-ribonukleinsavat oly módon, hogy higromicin B vagy G418 antibiotikumokkal szemben szelektálunk. Ilyen nem szelektálható dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia lehet például, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, olyan gének, amelyek poszt-transzlácionálisan módosult proteint határoznak meg, például a fibronectint vagy a hepatitis B antigént, mindjét termék transzlációt követően glükozileződik az eukariota sejtekben. Például úgy járunk el, hogy egy nem szelektálható génszekvenciát építünk be például a plazmidok Pvul helyére, például a pGD14 vagy a pGD15 plazmidba, amelyek tartalmazzák a pKC203 plazmid 2,75 kb nagyságú Sall/Bglli restrikciós fragmensét. A beépítés következményeként inaktiválódik a higromicin B rezisztencia gén, és így könnyen elkülöníthetők azok a transzformánsok, amelyek tartalmazzák a rekombináns plazmidot. Ezt úgy végezzük, hogy először G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciára szelektálunk, majd ezután azonosítjuk azokat a G418 rezisztens transzformánsokat, amelyek higromicin B-re nem rezisztensek. Hasonló módon, ha egy génszekvenciát beépítünk az Xhol helyre, úgy inaktiválódik a G418 rezisztencia gén. A transzformánsok, amelyek hordozzák a rekombináns plazmidot, könnyen elkülöníthetők oly módon, hogy először higromicin B rezisztenciára szelektálunk, majd ezután azonosítjuk azokat a higromicin B transzformánsokat, amelyek G418 antibiotikumra érzékenyek. Az eukariota vagy prokariota transzformánsok antibiotikum rezisztenciára való szelektálhatósága lehetővé teszi azoknak a rendkívül ritkán jelentkező sejteknek a hatékony izolálását, amelyek tartalmazzák a kiválasztott, nem szelektálható, számunkra érdekes dezoxi-ribonukleinsavat. Az antibiotikum rezisztencia funkcionális vizsgálata — ahogy azt az előzőekben leírtuk — felhasználható arra is, hogy szabályozó elemként és egyes antibiotikum rezisztencia gének kifejeződését meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat azonosítsunk. Ilyen szekvenciák például, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, a promoterek, az attenuatorok, represszorok, inducerek, riboszómális kötőhelyek és hasonlóak, amelyek felhasználhatók eukariota és prokariota sejtekben más strukturgének kifejezésének szabályozására. A találmány szerinti, higromicin B és G418 rezisztenciát meghatározó vektorok felhasználhatók különböző hosszúságú, kapcsolt dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciák stabilizálására is. Ezeket a géneket vagy fragmenseket, amelyeket kovalensen kötünk a higromicin B vagy G418 rezisztenciát meghatározó génhez és eukariota vagy prokariota sejtekben szaporítunk, fenntarthatok oly módon, hogy a 11 transzformánsokat higromicin vagy G418 antibiotikum hatásának tesszük ki, mégpedig olyan mennyiségű antibiotikum jelenlétében, amely toxikus a nem transzformálódott sejtekre. Ily módon a vektort elvesztett trartszformánsok, vagyis a bármely kovalensen kötött dezoxi-ribonukleinsavakat nem tartalmazó sejtek elpusztulnak és eliminálódnak a tenyészetből. Ily módon, a találmárty szerinti vektorokkal számunkra érdekes dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát stabilizálhatunk és tarthatunk fenn. A találmány szerinti klónozó vektorok és transzformánsok nemcsak nem módosított és transzlációt követően módosított polipeptidek közönséges előállítását teszi lehetővé eukariota sejtekben, de a jelenleg prokariota és eukariota sejtekben előállított különböző termékek jobb kihozatalát is lehetővé teszi. Ilyen termék, például, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, a sztreptomicin, a tylozin, a cefalosporinok, az aktaplamin, a bioszintetikus inzulin, a bioszintetikus humán inzulin, a bioszintetikus humán proinzulin, a bioszintetikus interferon és a bioszintetikus humán interferon. A találmány szerinti eljárással előállíthatunk továbbá olyan szelektálható vektorokat, amelyeket felhasználhatunk az alábbi termékek azonosítására, jellemzésére és az azokat meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciák rekonstruálására: 1) a gyakorlatban fontos fehérjék; 2) a metabolizmusban szerepet játszó és gyakorlatilag fontos eljárások és termékek előállításához vezető enzimek; vagy 3) szabályozó elemek és előnyösebb gén-kifejeződés. Ilyen dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciák például, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, a következők: szénhidrogének biodegradációját meghatározó dezoxi-ribonukleinsav, antibiotikum-származékok előállítása, például az alábbi antibiotikumoké, cefalosporin, tylozin és Actaplanin, antibiotikumok vagy más termékek bioszintézisét szabályozó és fokozó enzimek. Annak lehetősége, hogy ilyen dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat eukariota és prokariota sejtekbe építsünk és stabilizáljunk, igen fontos, mivel a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiával való bizonyos antibiotikumok és poszt-transzlációsan módosított proteinek előállítása eukariota gazdasejt jelenlétét igényli. Ezenfelül, mivel a találmány szerinti vektorok funkcionálnak prokariota sejtekben, például E. coli-ban, a velük való manipuláció és sokszorosításuk lehetségessé válik, így elkerüljük az eukariota sejtek használatakor jelentkező nehézségeket, ugyanis ezekben a technológiai lépések nehezen, vagy egyáltalán nem kivitelezhetők. A találmány szerinti eljárással új, többsejtű organizmus-változatokat vagy törzseket állíthatunk elő, amelyek jobban képesek tolerálni olyan antibiotikumok hatását, amelyek kiküszöbölik a belső paraziták, patogén 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
