195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
7 195248 8 lyek rezisztenciát biztosítanak egy, több mint egy, vagy az összes antibiotikummal szemben.oly módon, hogy a pKC203 vagy a pKC222 plazmid megfelelő dezoxi-ribonukleinsav-frag mensét egy megfelelő eukariota promoterhez képest lefelé haladva klónozunk. Prokariota replikont tartalmazva, a vektorok, a jelen leírásban a pGDIO, pGDll, pGD12, pGD13, pGD14 és pGD15 plazmidok mind eukariota, mind pedig prokariota gazdasejtekben funkcionálnak, és ily módon a találmány oltalmi köréhez tartoznak. Érthető módon, a találmány szerinti eljárás nemcsak a G418 rezisztencia gén aktivitása által a fentiekben ismertetett antibiotikumokkal szembeni rezisztenciákra vonatkozik. A pKC203 plazmid 7,5 kb nagyságú BglII fragmense egy prokariota replikont is tartalmaz, és így önmagához köthető plazmid előállítására. A kapott plazmidot pSC701 jellel jelöljük, ez funkcionális E. coli-ban, és olyan plazmid-származékok előállítására használható, amelyek kiindulási molekulaként előnyösek. így, a pSC701 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Haell enzimmel emésztjük, majd a pKC257 és pKC259 plazmidok előállítására ligáljuk. A pKC257 plazmid egy körülbelül 4,2 kb nagyságú molekula, és higromicin B-vel szembeni rezisztenciát határoz meg. A pKC259 plazmid körülbelül 5,0 kb nagyságú, és mind higromicin B, mind pedig apramicinnel szembeni rezisztenciát hordoz. A pKC257 plazmid dezoxi-ribonukleinsavának Sau3AI enzimmel való kezelését követő ligáció után még kisebb plazmidot kapunk, ezt pKC261 jellel jelöljük. Ez a plazmid szintén higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát határoz meg. A fenti plazmid-származékok E. coli sejtben funkcionálisak, és kiindulási molekulaként használjuk fel a találmány szerinti vektorok előállításakor. így például, ha a pKC259 plazmidot pSV5 gpt-be építjük, megkapjuk a pL03!4 és pL03l5 plazmidokat; ha a pKC257 plazmidot pSV5 gpt plazmidba építjük, úgy a pL0316 és pL0317 jelű plazmidokhoz jutunk; a pKC261 plazmidnak a pS.V5 gpt-be való építésekor a pL0318 és pL0319 plazmidokat kapjuk. Az összes, fentiekben ismertetett pLO sorozatú plazmid funkcionál mind prokariota, mind eukariota gazdasejtekben, és így a találmány oltalmi köréhez tartoznak. Előállíthatunk más kiindulási plazmidokat is. így például, ha a pUR222 plazmid plac-tartalmú Haell restrikciós fragmensét fáz előállításra vonatkozóan lásd Rüther, Nucleic Acids. Research, 9, 4087, 1981) beépítjük a pKC261 plazmidba, úgy megkapjuk a pKC275 jelű plazmidot. Az utóbbi plazmid körülbelül 3,6 kb nagyságú, és a higromicin'B antibiotikummal szembeni rezisztenciát határozza meg. Ezt a pLO320 és pL0321 szemléltető jellegű plazmidok előállítására beépíthetjük a pSV5 gpt plazmidba. Ezenfelül, ha egy, az YEp24 plazmid restrikciós fragmensét tartalmazó, 2 mikron nagyságú dezoxi-ribonukleinsavat építünk be a pKC259-be, úgy megkapjuk a pKC264 plazmidot, ugyanakkor, ha a pKC259 körülbelül 2,5 kb nagyságú BglII/ /Sáli fragmensét építjük be a megfelelően hasított YEp24 fragmensbe, úgy megkapjuk a pKC273 plazmidot, továbbmenve pedig, a pKC264 plazmid körülbelül 3,2 kb nagyságú Pstl fragmensét beépítve a pBR322-be, a pL0378 plazmidhoz jutunk. Mind a pL0378, mind pedig a pKC273 plazmid funkcionál élesztőben és E. coli ban, így a találmány oltalmi köréhez tartoznak. Az előzőekben ismertetett plazmid kiindulási anyagok felhasználásával előállított, fentiekben ismertetett és más vektorok ismertetésre kerülnek a 25. és 42. példákban. A témában jártas szakember előtt nyilvánvaló, hogy szakember más, olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat is képes előállítani vagy izolálni, amelyek szintén meghatároznak higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát, vagy külön-külön, vagy kombinációban; és érthető, hogy ezeket a szekvenciákat felhasználhatjuk a leírásban szereplő rezisztencia gének és szabályozó elemek helyett. Ezenfelül előállíthatók a 7,5 kb nagyságú BglII fragmens vagy a 2,5 kb nagyságú Sall/BglII szubfragmensek funkcionális származékai oly módon, hogy hozzákötünk, eliminálunk vagy helyettesítünk bizonyos, a genetikai kódnak megfelelő nukleotidokat. Szakember előtt nyilvánvaló, hogy ilyen származékok és más, higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szegmensek a találmány oltalmi köréhez tartoznak. Bár a jelen leírásban szemléltető példaként a pBR322 replikont adjuk meg prokariota replikonként, hasonló kísérletekhez több, más replikont is felhasználhatunk. Ilyen prokariota replikon például, de nem az oltalmi kört szűkítő jelleggel, a következők lehetnek: pMBl replikon (Betlach és munkatársai. Fed. Proc., 35, 2037, 1976), NR1 replikon (Rownd és Mickel, Nature, 234, 40, 1971), RK2 replikon (Beringer, J. Gen. Microbiol., 84, 188, 1974), RK6 replikon (Kontomichalou és munkatársai. J. Bacteriol., 104, 34, 1970), pSCIOl replikon (Cohen és Chang, J. Bacteriol., 132, 734, 1977), RPI replikon (Grinsted és munkatársai, J. Bacteriol., 110, 529, 1972), RP4 replikon (Nagahari és munkatársai, Gehe., I, 141, 1977), RSF1010 replikon (Guerry és munkatársai, J. Bacteriol., 117, 619, 1974), PUB110 replikon (Gryczan és munkatársai, J. Bacteriol., 134, 318, 1978) és az SLP1.2 replikon (Bibb és munkatársai, Nature, 284, 526). A szakember számára érthető, hogy az irodalomban leírt több más prokariota replikont is felhasználhatjuk a találmány szerinti eljárás során, és általában egyes prokariota replikonok előnyösek másokkal szemben, bizonyos gazdasejtek esetén. így pél5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
