195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
mid 9,3 kb nagyságú, és tartalmazza a replikációs origint, és a pBR322 plazmid ampicillin-rezisztencia markerét; tartalmazza továbbá a funkcionális SV40 korai promotert, amely a xantin-guanin-foszfo-ribozil-transzferáz (gpt) meghatározó gén tarnszkripcióját kontrollálja. A pSV5 gpt plazmid restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 2. ábrán mutatjuk be. Ahogy az a szakember számára világos, a pSV5 gpt plazmid mind E. coliban, mind pedig eukariota sejtekben, például emlős sejtekben képes replikálódni. A pSV5 gpt plazmid BglII restrikciós helye lehetővé teszi a pKC203 plazmid 7,5 kb nagyságú BglII restrikciós íragmenssel való közvetlen ligációt. így a higromicin B és G418 rezisztenciát meghatározó 7,5 kb nagyságú fragmens beépíthető a pSV5 gpt plazmidba, ha azt BglII enzimmel kezeljük. A 7,5 kb nagyságú fragmens mindkét lehetséges orientációja azonos valószínűséggel következik be, így,- ha a 7,5 kb nagyságú fragmenst beépítjük a pSV5 gpt-be, kétféle plazmidot kapunk, ezeket pKC214 és pKC2!5 jellel jelöljük. A pKC2l4 és a pKC215 plazmidok restrikciós és funkcionális - térképét sorrendben a 3. és 4. mellékelt ábrán mutatjuk be. A példa szerinti pKC214 és a pKC215 plazmidokban az eukariota promoter szomszédos az asszociált kontrollelemeket tartalmazó és a higromicin B és G418 rezisztenciát meghatározó génekkel, és az SV40 korai promoterrel. Az eukariota promoter szabályozza a transzkripciót, és részben regulálja a rezisztencia gének kifejeződését eukariota gazdasejtekbe transzformálva. Ezenfelül a fenti plazmidok kromoszómális integrációt szenvednek eukariota sejtekben, és ezért a normális eukariota sejtosztódás során a kromoszóma részeként replikálódnak. Bár az eukariota promotert jelen leírásban a pKC2l4 és a pKC215 szemléltető jellegű plazmidokban SV40 korai promoterként adjuk meg (O’Hare és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 78, 1527, 1981; Mulligan és Berg, Science, 209, 1422, 1980), használhatunk több, más eukariota promotert is. Ilyen eukariota promoter például, de nem korlátozó jelleggel, az SV40 késői promoter. (Hamer és Leder, Nature, 281, 35, 1979), a HSVITK promoter (Pellicer és munkatársai, Cell, 14, 133, 1978), az adenovirus promoter (Thummel és Tjian, Cell, 23, 825, 1981), az adenovirus 2 (Ad 2) késői promoter (Solnick, Cell, 24, 135, 1981), a polyoma promoter (Collantuoni és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 77, 3850, 1980), az egér szarkóma vírus promoter (Van Beveren és munkatársai, Nature, 289, 258 (1981)), az élesztő trp-l promoter (Stinchcomb és munkatársai, Nature, 282, 39, 1979), az élesztő leu 2 promoter (Ratzkin és Carbon, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 74, 487, 1977), az élesztő kis 3 promoter (Broach és munkatársai, Gerne, 8, 121, 1979), az élesztő al5 4 kohol-dehidrogenáz promoter és az élesztő citokróm C promoter (Guarente és Ptashne, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 78, 2199, 1981). A pKC214 és a pKC215 szemléltető jellegű plazmidok előállításakor egy BglII fragmenst építünk be a pSV5 gpt génbe, lefelé haladva a korai SV40 promotertől, ennek ellenére más, analóg előállításokat is végezhetünk; ezekbe egy vagy több, fentiekben felsorolt eukariota promotert használhatunk, így például a pKC203 plazmidból vagy ennek egy származékából higromicin B és G418 rezisztencia gént tartalmazó BglII lineáris dezoxi-ribonukleinsav fragmens állítható elő oly módon, hogy a plazmidot ismert módon BglII restrikciós enzimmel kezeljük. Ezt a fragmenst közvetlenül vagy szintetikus dezoxi-ribonukleinsav linkerekkel (ezek az irodalomból ismertek) rezisztenciát meghatározó fragmenshez köthetjük, és az így előállított dezoxi-ribonukleinsav szakaszt megfelelő eukariota prometertől (például az Ad 2.vagy az élesztő citokróm C promotertől) lefelé haladva klónozhatjuk. Egy prokariota replikonnal való ligáció során ezek a készítmények (a leírásban pGDL, pGD2, pGD3 és pGD4 plazmidokként jelöljük) funkcionálnak eukariota és prokariota gazdasejtekben, és így a találmány oltalmi köréhez tartoznak. A szakember számára érthető, hogy különböző eukariota promotereket felhasználva előállíthatunk további termékeket is, egyes eukariota promoterek és készítmények előnyösebbek bizonyos gazdasejtek használatakor. A pKC214, pKC215, pGDI, pGD2, pGD3 és pGD4 szemléltető jellegű plazmidokkal jellemzett termékekben lévő higromicin B és G418 rezisztencia gének és szabályozó elemek tartalmazzák a pKC203 plazmid 7,5 kb nagyságú BglII fragmensét. Ezen BglII fragmensen belül a dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia meghatározza a rezisztenciát, ez a hely pedig egy további, 2,5 kb nagyságú, Sall/BglII íragmensen belül lokalizálódik. A fenti 2,5 kb nagyságú Sall/BglII fragmens restrikciós és funkcionális térképét a pKC222 plazmid részeként adjuk meg a mellékelt 5. ábrán. A pKC222 plazmid felhasználható az egyes gének izolálására, a kontroll elemek elkülönítésére, amelyek együttesen az egyes antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát határozzák meg. így például az 1,51 kb nagyságú BglII/ /Sacl fragmens a pKC222 plazmidban tartalmazza a higromicin B rezisztencia gént és a szabályozó elemet, ugyanakkor az 1,65 kb nagyságú EcoRI/Sall fragmens a G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciát biztosító gént és szabályozó elemet hordozza. Ügy hisszük, hogy a G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó gén, és a génhez kapcsolódó szabályozó elem az apramicinre és a tobramicinre is rezisztenciát biztosít érzékeny sejtekben, például E. coliban. Ily módon olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok állíthatók elő, ame6 195248 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 I 60 i 65
