195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
195248 ban megadottak szerint végezzük. A kapott E. coli K12 BE783/pL0316 és az E. coli K12 BE783/pL0317 transzformánsokat felhasználjuk a pL0316 és a pL0317 plazmidok izolálására. Mint ahogy a 30C. példában megadtuk, két orientációjú plazmidot kapunk, attól függően, hogy milyen a beépített rezisztenciát hordozó fragmens orientációja. A plazmidokat és a kapott transzformánsokat ismert módszerekkel könnyen megkülönböztethetjük és azonosíthatjuk. A pL03I6 és pL0317 plazmidok egy restrikciós helyét és funkcionális térképét mutatjuk be a mellékelt 9. ábrán. 34. példa A Mouse Ltk“/pL0316 és a Mouse Ltk“/ /pL03!7 előállítása A 4. példában megadottak szerint járunk el, a fenti két termék előállítására, azzal a különbséggel, hogy a pKC2I4 plazmid helyett vagy a pL0316, vagy a pL0317 plazmidot használjuk. Az így kapott Mouse Ltk“/ /pL0316 és a Mouse Ltk“/pL0317 transzformánsokat külön-külön tömegtenyészetben növesztjük. 35. példa A pL0318 és a pL0319 plazmidok, továbbá az E. coli K12 BE783/pL03l8 és az E. coli K12 BE783/pL0319 transzformánsok előállítása A kísérleteket a 33. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC257 plazmid helyett a pKC26I plazmidot használjuk. A kapott E. coli K12 BE783/ /pL0318 és az E. coli K12 BE783/pL0319 transzformánsokat felhasználjuk a pL03l8 és a pL0319 plazmidok izolálására. Ahogy azt a 30C. példában ismertettük, attól függően, hogy a beépített rezisztenciát hordozó fragmens milyen orientációjú, két orientációjú plazmidot kapunk. A plazmidokat és a kapott transzformánsokat könnyen megkülönböztethetjük és ismert módszerekkel azonosíthatjuk. A pL0318 és a pL0319 plazmidok restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 9. ábrán adjuk meg. 36. példa A Mouse Ltk“/pL0318 és a Mouse Ltk“/ /pL0319 előállítása A kísérleteket külön-külön a 4. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy pKC214 plazmid helyett a pL0318 vagy a pL0319 plazmidokat használjuk. Az így előállított Mouse Ltk“/pL0318 és a Mouse Ltk“/pL0319 transzformánsokat külön-külön tömeges tenyészetben növesztjük. 37. példa A pL0321 és a pLO320 plazmidok, továbbá az E. coli K12 Bel041/pL0320 és az E. coli KI2 BE1041/pLO32l transzformánsok előállítása 29 A kísérleteket a 33. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC257 plazmid helyett a pKC275 jelű plazmidot használjuk. A kapott E. coli K12 BE1041/pL0320 és az E. coli K12 BE1041/ /pL0321 transzformánsokat felhasználjuk a pLO320 és a pL0321 plazmidok izolálására: Ahogy azt a 30C. példában kifejtettük, a beépített rezisztenciát hordozó fragmens orientációjától függően két orientációjú plazmidot kapunk. A plazmidokat és a kapott transzformánsokat ismert módszerekkel könynyen megkülönböztethetjük és azonosíthatjuk. A pLO320 és a pL032I plazmidok restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 9. ábrán adjuk meg. 38. példa A Mouse Ltk“/pLO320 és a Mouse Ltk“/ /pL0321 előállítása A 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pK214* plazmid helyett vagy a pLO320, vagy a pL0321 plazmidokat használjuk. Az előállított Mouse Ltk“/pLO320és a Mouse Ltk“/pL0321 transzformánsokat tömeges tenyészetben, különkülön növesztjük. 39. példa A pKC273 plazmid és az E. coli K12 BE783/ /pKC273 transzformánsok előállítása A) A 2 p és ura+ gént tartalmazó, BamHI és a Sail végekkel rendelkező, lineáris dezoxi-ribonukleinsav előállítása TE-pufferban lévő, 5 pl (5 pg) pYEp24 plazmidot, 5 pl ditio-treitolt, 5 pl (1000 mg/ /ml) borjúszérum albumint, 25 pl vizet, 5 pl (5 egység) BamHI restrikciós enzimet és 5 pl alábbi összetételű reakcióelegyet inkubálunk 37°C hőmérsékleten, 1 órán át: 1500 mmól nátrium-klorid, 60 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,9, 60 mmól magnézium-klorid. Ezután 70°C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, 5 percen át. A BamHI enzimmel emésztett dezoxi-ribonukleinsavat jeges fürdőben lehűtjük, etanollal kicsapjuk, 30 pl vízben oldjuk, az oldathoz 5 pl Sáli puffert adunk (1500 mmól nátrium-klorid, 60 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,9, 60 mmól magnézium-klorid), a reakcióelegyet 5 pl ditio-treitollal, 5 pl (1000 mg/ml) borjúszérum albuminnal és 5 pl (5 egység) Sáli restrikciós enzimmel egészítjük ki. A kapott reakcióelegyet 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 5 percen át 70°C hőmérsékleten tartjuk, végül 4°C hőmérsékletre hűtjük. Ezután fenollal, és kloroform és izoamil-alkohol 24:1 arányú elegyével extraháljuk, végül etanollal kicsapjuk. A kapott csapadék tartalmazza a lineáris dezoxi-ribonukleinsavat, ezt 5 pl, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk, és további felhasználásra 4°C hőmérsékleten tároljuk. B) A BamHI és az Sail végekkel rendelkező, higromicin B rezisztencia gént tartal-30 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 16
