195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
195248 mázó lineáris dezoxi-ribonukleinsav előállítása A lineáris dezoxi-ribonukleinsavat a 39A. példában megadottak szerint állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy YEp24 plazmid helyett a pKC259 plazmidot használjuk. A kapott csapadék tartalmazza a lineáris dezoxi-ribonukleinsavat, ezt 5 pl, 5 mmólos nátrium-kloridoldatban oldjuk, és további felhasználásra 4°C hőmérsékleten tároljuk. C) Ugálás és transzformálás Az E. coli K12 BE783 sejtek transzformálását és a ligálást a 28C. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 39A. és B. példák szerint előállított dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket használjuk a pUR222 és a pKC261 plazmidok Haell fragmensei helyett. A Jigációt követően transzformációt végzünk. A kapott transzformánsok szelekciós, gél-elektroforézises (Rao és Rogers, 1978) és más vizsgálatok szerint tartalmazzák az adott plazmidot. Egy ilyen transzformánst E. coli K12 BE783/pKC273 jellel jelöltünk, szelektáltunk, szélesztettünk, tenyésztettünk, és a pKC273 plazmid izolálására használtunk. A pKC273 plazmid egy restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 10. ábrán adjuk meg. 40. példa A Saccharomyces cerevisiae/pKC273 előállítása Élesztőt (Saccharomyces cerevisiae) növesztünk 1% élesztőkivonatot, 2% bakto-peptont és 1 % glükózt tartalmazó táptalajon, ismert mikrobiológiai módszerekkel. Az élesztő pKC273 plazmiddal való transzformálását Hinnen és munkatársai szerint végezzük (Proc. Nat. Acad. Sci„ USA, 75, 1929, 1978). A transzformánsokat uracilmentes táptalajon való növekedési képességük alapján szelektáljuk (Ura+ íenotípus). Az Ura+ transzformánsokat megvizsgáljuk 200 mg/ml higromicin B-t tartalmazó komplett táptalajon való növekedésük szempontjából. Ez az antibiotikum-mennyiség letális nem-transzform'ált sejtekre. A Saccharomyces cerevisiae/pKC273 transzformáns sejtek növekednek ezen a táptalajon, míg a nem transzformálódott Saccharomyces cerevisiae sejtek elpusztulnak. 41. példa A pL0378 plazmid és az E. coli K12 BE783/ /pL0378 transzformánsok előállítása A) A pBR322 plazmid emésztése Pstl enzimmel A 28B. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pUR222 plazmid, a Haell restrikciós enzim és az ott megadott reakcióelegy helyett a pBR322 plazmidot, a Pstl restrikciós enzimet és az alábbi összetételű reakcióelegyet használjuk: 500 mmól nátrium-klorid, 60 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,4, 60 mmól magnézium-31-klorid. A kapott Pstl fragmenseket 5 pl, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk. B) A pKC264 plazmid Pstl enzimmel való emésztése Az emésztést a 41 A. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pBR322 plazmid helyett a pKC264 jelű plazmidot használjuk. A kapott Pstl fragmenseket 5 pl térfogatú, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk. C) Ugálás és transzformálás Az E. coli K12 BE783 sejtek transzformálását ( és a ligálást) a 280. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pUR222 és a pKC261 plazmidok Haell fragmensei helyett a 41A. és B. példákban megadottak szerint előállított dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket használjuk. A ligációt követően transzformációt végzünk. Egyes transzformánsok, ahogy azt az antibiotikum szelekciós, gél-elektroforézises (Rao és Rogers, 1978), és más vizsgálatok mutatják, tartalmazzák az adott plazmidot. Egy ilyen transzformánst E. coli K12 BE783/ /pL0378 jellel jelölünk, szelektáljuk, szélesztjük, tenyésztjük és felhasználjuk a pL0378 plazmid izolálásához. Ahogy azt a 30C. példában ismertettük, attól függően, hogy a beépített rezisztenciát hordozó fragmens milyen orientációjú, két orientációjú plazmidot kapunk. Ezért, a pL0378 plazmidon túlmenően, a fenti eljáás során fordított orientációjú plazmidok is keletkeznek. A témában jártas szakemberek könnyen megkülönböztethetik és azonosíthatják ezeket a plazmidokat, és ismert módszerekkel elkülöníthetik a kapott transzformánsokat. A pL0378 egy restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 10. ábrán mutatjuk be. 42. példa A Saccharomyces cerevisiae/pL0378 előállítása A transzformációt a 40. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC273 plazmid helyett a G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó gént tartalmazó pL0378 plazmidot használjuk. A transzformánsokat ismert módon választjuk ki úgy, hogy vizsgáljuk a recipiens élesztősejteket a plazmid dezoxi-ribonukleinsav jelenlétére. Az előállítandó Saccharomyces cerevisiae/pL0378 transzformánsokat könnyen azonosítjuk és izoláljuk. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó két különböző strukturgént és a hozzájuk kapcsolódó szabályozó szekvenciát hordozó pKC203 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy E. coli JR225 (ATCC 31912) sej-32 17 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
