195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
195248 C) Ligálás és transzformálás A pKC259 és az YEp24 plazmidok EcoRI enzimmel emésztett fragmenseit (a íragmenseket a 29A. példa és a 29B. példa szerint állítottuk elő) ligáljuk, a ligációs eleggyel pedig E. coli K12 BE783 sejteket transzformálunk. A ligálást és a transzformálást a 28C. példa szerint végezzük. A kizárólag a 7,2 kb nagyságú, higromicin B, apramicin és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó plazmidot tartalmazó transzformánsokat E. coii KI2 BE783/pKC264 jellel jelöljük. Egy ilyen transzformánst szelektálunk, szélesztünk, tenyésztünk és felhasználunk további plazmid-izolálásokhoz. A témában jártas szakember előtt világos, hogy a 2 p nagyságú dezoxi-ribonukleinsavat mindkét irányban kapcsolhatjuk, és így a pKC264 plazmid és ugyanakkor a fordított orientációjú plazmidok is létrejönnek a fenti eljárássorán. A különböző plazmidok és a kapott transzformánsok könnyen izolálhatok és azonosíthatók, ismert módszerekkel. A pKC264 plazmid restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 8. ábrán mutatjuk be. 30. példa A pL0314 és a pL0315 plazmidok és az E. coli K12 BE783/pL0314 és az E. coli K12 BE783/pL0315 transzformánsok előállítása A) A pKC259 plazmid emésztése BglII enzimmel A 28B. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pUR222 plazmid, a Haell restrikciós enzim és az enzimhez tartozó reakcióelegy helyett a pKC259 plazmidot, a BglII restrikciós enzimet és az enzimhez tartozó reakcióelegyet használjuk. A kapott BglII enzimmel hasadó fragmenseket 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk. B) A pSV5 gpt plazmid emésztése a BglII enzimmel Az emésztést a 28B. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pUR222 plazmid, a Haell restrikciós enzim és az enzimhez tartozó reakcióelegy helyett a pSV5 gpt plazmidot, a BglII restrikciós enzimet és az ehhez az enzimhez tartozó reakcióelegyet használjuk. A BglII fragmenseket 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk. C) Ligálás és transzformálás A ligálást a 28C. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC261 és pUR222 emésztett plazmidok helyett a pKC259 és a pSV5 gpt plazmidok BglII enzimmel kapott fragmenseit használjuk. A ligációs eleggyel E. coli Ki2 BE783 sejteket transzformálunk Wensink módszere szerint (1974) olyan TY lemezeken, amelyek ml-enként 20C pg higromicin B antibiotikumot tartalmaznak. Egyes transzformánsok a gél-elektroforézises (Rao és Rogers, 1978) 27 és más vizsgálatok szerint kizárólag a pL03I4 vagy a pL0315 plazmidot tartalmazzák. Ezeket a transzformánsokat szelektáljuk, szélesztjük és tenyésztjük, két törzset E. coli KI2 BE783/pL0314 és az E. coli KI2 BE783/ /pL0315 transzformánsoknak nevezünk. A transzformánsokat felhasználjuk a pL0314 és a pL0315 plazmidok további izolálására. Mivel a dezoxi-ribonukleinsav-frágmensek mindkét irányban kötődnek, két orientációjú rekombináns plazmidot kapunk. Szakember számára érthető, hogy az előállítani kívánt plazmidokat könnyen megkülönböztethetjük és ismert módszerekkel, restrikciós enzimes analízissel és elektroforézissel azonosíthatjuk. A pL0314 és a pL0315 plazmidok restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 9. ábrán mutatjuk be. 31. példa A Mouse LtkVpL0314 előállítása A kísérletet a 4. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett a pL0314 plazmidot használjuk. Az így kapott Mouse Ltk”/ /pL0314 transzformánsokat tömegesen tenyésztjük. 32. példa A Mouse Ltk~/pL0315 előállítása A 4. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 helyett a pL0315 plazmidot használjuk. Az így előállított Mouse Ltk_/pL0315 transzformánsokat tőmegtenyészetben növesztjük. 33. példa A pL03!6 és a pL0317, valamint az E. coli K12 BE783/pL0316 és az E. coli K12 BE783/ /pL03!7 transzformánsok előállítása A) A pKC257 plazmid emésztése SacI enzimmel, és a BglII linkerek hozzákapcsolása Az emésztést a 28B. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pUR222 plazmid, a Haell restrikciós enzim és a hozzá tartozó reakcióelegy helyett a pKC257 plazmidot, az SacI restrikciós enzimet és az ehhez az enzimhez tartozó reak‘ cióelegyet (600 mmól nátrium - klorid, 100 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,4, 100 mmól magnézium-kiorid) használjuk. A BglII linkereket [(dCAGATCTG), Collaborative Research Inc., 1365 Main Street, Waltham, MA, 02154] a SacI enzimmel emésztett pKC257 plazmid-végekhez St. John és munkatársai szerint kötjük (J. Mól. Bioi., 152, 317, 1981). B) Ligálás és transzformálás A BglII végekkel rendelkező lineáris pKC257 plazmidot hozzákötjük a 30B. példa szerint előállított BglII enzimmel emésztett pSV5 gpt plazmidhoz. A reakciót a 30C. példában megadottak szerint végezzük. A ligációs eleggyel E. coli K12 BE783 sejteket transzformálunk, a transzformálást a 30C. példá-28 15 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
