195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
zium-klorid. A pKC261 plazmid körülbelül 3,2 kb nagyságú, és meghatározza a higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát. A kapott ligációs eleggyel a 25. példában megadottak szerint eljárva E. coli K12 BE783 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat, a leírásban E. coli K12 BE783/pKC261 jellel jelöljük, szelektáljuk, és felhasználjuk őket a pKC261 plazmid izolálására. A plazmid izolálását az 1A. példa szerint végezzük. A higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát. biztosító gén jelenlétét a pKC261 plazmidban transzformálással, szelekcióval és dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia-analízissel tovább bizonyítjuk. A pKC26l plazmid restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 7. ábrán adjuk meg. 28. példa A pKC275 plazmid és az E. coli K12 BE1041/ /pKC275 transzformánsok előállítása A) A pKC271 plazmid részleges emésztése Haell enzimmel 5 pl (5 pg), a 27. példában megadottak szerint izolált pKC261 plazmidot TE-puffer, 5 pl ditio-treitol, 5 pl (1000 mg/ml) borjúszérum albumin, 25 pl víz, 5 pl (5 egység) Haell restrikciós enzim és 5 pl reakcióelegy (600 mmól nátrium-klorid, 100 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,4, 100 mmól magnézium-klorid) jelenlétében, 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubálunk. A reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet 5 percen át 70°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután jeges vízfürdőben lehűtjük, fenollal, majd ezután kloroform és izoamil-alkohol 24:1 arányú elegyével extratíaljuk, végül etanollal kicsapjuk. A kapott Haell restrikciós fragmenseket 5 pl, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk. B) A Haell véget tartalmazó, körülbelül 394 nt piac fragmens izolálása Az 1. példában megadottak szerint eljárva E. coli K12 BEI 166/pUR222 sejtből izoláljuk a pUR222 plazmidot, majd 5 pl (5 pg) plazmidot TE-pufferban oldunk, és Haell enzimmel emésztünk, a 28A. példában megadottak szerint eljárva, azzal a különbséggel, hogy a restrikciós elegyet 2 órán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten, azaz nem részleges, hanem teljes emésztést végzünk. A kapott Haell restrikciós fragmenseket 5 pl, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk. Az E. coli K12 BEI 166/pUR222 törzs a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois törzsgyűjteményében található meg. A törzs a kutatók számára hozzáférhető a B-15023 számon, és felhasználható a pUR222 plazmid forrásaként. C) Ligálás és transzformálás 4 pl pKC261 és pUR222 plazmidból a 28A., illetve a B) példában megadottak szerint előállított Haell restrikciós fragmenst, 14 25 31 pl vizet, 5 pl (10 mmól) ATP-t, 5 pl ligációs keveréket (lásd: előző példa) és 1 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt (körülbelül 10s New England Bio Lab Units) elegyítünk, a reakcióelegyet 16 órán át 16°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután 5 percen át 70°C hőmérsékleten hagyjuk állni a reakcióelegyet, és ezzel leállítjuk a reakciót. Az így kapott ligációs elegyet jégfürdőben lehűtjük. Ezután E. coli K12 BE 1041 törzset transzformálunk az eleggyel (a törzs a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois törzsgyűjteményében található meg B-15021 sorszámon). A transzformációt a 25. példában megadottak szerint végezzük. A 3,6 kb nagyságú pKC275 plazmidot tartalmazó transzformánsokat E. coli K12 BE1041/pKC275 jellel jelöljük. Az egyik ilyen transzformánst szelektáljuk, szélesztjük, tenyésztjük és felhasználjuk további plazmid-izolálásokhoz. A 3,94 nt piac-tartalmú fragmenst és a pKC275 plazmid részletes szerkezetét gél-elektroforézissel és restrikciós enzim-analízissel vizsgáljuk. Mivel a pKC261 plazmid három helyen hasítható Haell restrikciós enzimmel, a Haell emésztést követően különböző Haell fragmenseket kapunk. így a fentiek szerint eljárva, különbözőképpen orientált plazmid izomereket kapunk, és a transzformánsok izolálhatok és ismert módszerekkel azonosíthatók. A pKC275 plazmid restrikciós helyét és funkcionális térképét mutatjuk be a mellékelt 8. ábrán. 29. példa A pKC264 plazmid és az E. coli K12 BE783/ /pKC264 transzformáns előállítása A) A pKC259 plazmid EcoRI enzimmel való emésztése Az emésztést a 28. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC259 plazmidot és az EcoRI restrikciós enzimet használjuk, reakcióelegyként az alábbi összetételű elegyet adagoljuk:500mmól nátrium-klorid, 1000 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, 50 mmól magnézium-klorid. A 28. példában a pUR222 plazmidot és Haell restrikciós enzimet, és az ezeknek megfelelő reakcióelegyet használtuk. A kapott EcoRI restrikciós fragmenseket 5 pl, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk. B) Az YEp24 plazmid emésztése EcoRI enzimmel a 2 p méretű dezoxi-ribonukfeinsav izolálására Az YEp24 plazmidot az E. coli KI2 BE1139/YEp24 törzsből izoláljuk, az 1. példában megadottak szerint eljárva. Az E. coli K12 BE1139/YEp24 törzs a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois törzsgyűjteményében található meg B-15022 sorszámon. Az YEp24 plazmid EcoRI enzimmel való emésztését a 29A. példa szerint végezzük, a kapott EcoRI restrikciós fragmenseket pedig 5 pl, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk. 26 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
