195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
195248 24. példa A Mouse Ltk~/pGDI5 előállítása A 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a transzformáció során a pKC2I4 plazmid helyett a pGD15 plazmidot használjuk. Az így előálliV tott Mouse Ltk~/pGD14 sejteket tenyészetben növesztjük. 25. példa A pSC701 plazmid és az E. coli KI2 BE827/ /pSC701 transzformáns előállítása 5 pl (5 pg), az 1. példában megadottak szerint előállított pKC203 plazmidot TE-pufferban (10 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = = 8,0, 1 mmól etilén-diamino-tetraecetsav), 5 pl DTT (100 mmól ditio-treitol), 5 pl (1000 mg/ml) borjúszérum albumin, 25 pl víz, 5 pl (5 egység) Bglll restrikciós enzim és 5 pl 1 OX reakcióelegy (a reakcióelegy a következő összetételű: 600 mmól nátrium-klorid, 100 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, 100 mmól magnézium-klorid) jelenlétében 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubálunk. A reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet 5 percen át 70°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután jeges fürdőben lehűtjük az elegyet, fenollal, majd kloroform és izoamil-alkohol 24:1 arányú elegyével extraháljuk, és ezt követően etanollal kicsapjuk. A kapott Bglll restrikciós fragmenseket 5 pl, 5 mmólos nátrium-klorid-oldatban oldjuk, majd ligáljuk. A ligációs reakciót 1 pl Bglll restrikciós enzimmel kezelt dezoxi-ribonukleinsav, 38 pl víz és 5 pl, 10 mmólos ATT oldat, továbbá 5 pl ligációs elegy (összetétele a következő: 500 mmól trisz-hidrogért-klorid, pH=7,8, 200 mmól ditio-treitol, 100 mmól magnézium-klorid), továbbá 1 pl T4 dezoxi-ríbonukleinsav-ligáz (körülbelül 105 New England Bio Láb egység) jelenlétében végezzük, 16°C hőmérsékleten, 16 órán át. A reakciót úgy állítjuk le, hogy 5 percen át 70°C hőmérsékleten tartjuk a reakcióé legyet. Jeges vízfürdőben ezután lehűtjük, a kapott ligációs eleggyel pedig E. coli K12 BE827 sejteket transzformálunk gyakorlatilag Wensink módszere (1974) szerint, TY lemezeken, amelyek 200 mg/ml higromicin B antibiotikumot tartalmaznak. A gélelektroforézises (Rao és Rogers, 19.78) és más vizsgálatok szerint egyes transzformánsok tartalmazzák a 7,3 kb nagyságú, előállítandó plazmidot. Egy ilyen transzformánst E. coli K12 BE827/ /pSC701 jellel jelöltünk. A szelektált, 200 pg/ /ml higromicin B antibiotikumot tartalmazó TY agaron szélesztett, majd hagyományos mikrobiológiai módszerekkel tenyésztett transzformánsból az 1A. példában megadottak szerint eljárva izoláljuk a pS€701 plazmidot. A higromicin B és G418 rezisztenciát meghatározó gének jelenlétét a pSC701 plazmidban transzformációval, szelekcióval és restrikciós enzim-analízissel bizonyítjuk. A mellékelt 6. ábrán megadjuk a pSC701 plaz-23 mid restrikciós helyét és funkcionális térképét. 26. példa A pKC257 és a pKC259 plazmidok és az E. coli K12 BE783/pKC257 és az E. coll KI 2 BE783/pKC259 transzformánsok előállítása A 25. példában megadottak szerint eljárva állítjuk elő a plazmidot, azzal a különbséggel, hogy a pKC203 plazmid, a Bglll restrikciós enzim és az ott megadott reakcióelegy helyett a pSC701 és a Haell restrikciós enzimet, valamint az alábbi összetételű reakcióelegyet használjuk: 60 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, 60 mmól magnézium-klorid. A pSC701 plazmid több mint egy Haell restrikciós helyet tartalmaz, így Haell enzimmel emésztve, és ezután ligációt végezve különböző plazmidok elegyét kapjuk. A kapott ligációs elegy tartalmazza a körülbelül 4,2 kb nagyságú pKC257, a higromicin B rezisztenciát meghatározó plazmidot, továbbá a körülbelül 5,0 kb nagyságú, higromicin B, G418 és apramicin rezisztenciát meghatározó pKC259 plazmidot. Ezzel az eleggyel E. coli K12 BE783 sejteket a (Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois törzsgyűjteményében B-15020 számon található) transzformálunk, a 25. példában megadottak szerint eljárva. A transzformánsokat 200 pg/ /ml higromicin B antibiotikumot tartalmazó TY agaron szélesztve szelektáljuk, majd külön-külön tenyésztjük, hagyományos mikrobiológiai módszerekkel. A pKC257-et tartalmazó transzformánsokat könnyen azonosítjuk oly módon, hogy keressük a higromicin B antibiotikum rezisztens sejteket. A pKC259 plazmidot tartalmazó transzformánsok azonosítását apramicin és higromicin B rezisztencia alapján végezzük. Az E. coli K12 BE783/pKC257 és az E. coli KI2 BE783/ /pKC259 jelű transzformánsokat az adott sorrendben felhasználjuk a pKC257 és a pKC259 plazmidok izolálására. A plazmidok izolálását az 1A. példában megadottak szerint végezzük. Az antibiotikum rezisztencia gének jelenlétét az'egyes plazmidokban ezután transzformációval, szelekcióval és restrikciós enzimmel végzett analízissel bizonyítjuk. A pKC257 és a pKC259 plazmidok restrikciós helyét és funkcionális térképét a mellékelt 6. és 7. ábrán mutatjuk be. 27. példa A pKC261 plazmid és az E. coli KI2 BE783/ /pKC261 transzformáns előállítása A 25. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pSC701 plazmid, a Bglll restrikciós enzim és az ott megadott reakcióelegy helyett a pKC257 plazmidot, a Sau3 A1 restrikciós enzimet és az alábbi összetételű reakcióelegyet használjuk: 500 mmól nátrium-klorid, 60 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5 és 50 mmól magné-24 13 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
