195247. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herpesz vírusokra fajlagos immunológiai anyagok előállítására és kimutatásukra
195247 a 268—287 [1] szintetikus peptideket ciszteinnel, amelyeket a karboxi-terminálishoz adunk, a Peninsula Labs. Inc. állítja elő. A 266— 279 [1] és 266—279 [2] szintetikus peptideket a jól ismert szilárd fázisú eljárásokkal állíthatjuk elő, Merrifield módszerét követve [J. Am. Chem. Soc. 85, 2149—2154 1963)]. A kürtőscsiga hemocianinhoz (keyhole limpet hemocyanin, KLH) való peptid kapcsolás eljárásait általában úgy végezzük, ahogyan ezt Liu és munkatársai leírták [Biochemistry, 18, 690—697 (1979)]. Az immunfolt mérésekben (immunobiot assay) való alkalmazáshoz a peptideket 0,1 mól/liter triszt (pH 7,8) és 0,15 mól/liter HCI-t tartalmazó oldatban alkalmazzuk. D. Natív és denaturált gD előállítása Hacsak másképpen nem jelezzük, a gD—1 -et és gD—2-t fertőzött sejtek citoplazma-extraktumaiból tisztítjuk affinitás kromatográfíával, amint ezt Eisenberg és munkatársai leírták. [J. Virol. 41, 477—488 (1982)]. Az immun-abszorbens oszlopról KSCN-el eluált és 0,01 mól/liter triszt (pH 7,5), 0,15 mól/liter NaCl-t, 0,1% Nonidet-P40-et (NP—40) tartalmazó pufferrel (TSN puffer) szemben dializált fehérjéket nevezzük „natív“ konformációjú fehérjéknek. A denaturált anyagok előállításához tisztított gD—1 -et vagy gD—2-t szuszpendálunk „szétzúzó“ pufferben, hogy a végső koncentráció 3% SDS, 100 mmól/liter trisz, pH 7,0, 10% 2-merkapto-etanol és 0,5% glicerin legyen. A mintát 5 percig forraljuk. Jód-acetamidot (0,1 mól/liter 0,1 mól/literes trisz-ben, pH8,0) adunk hozzá, hogy a jód-acetamid végső koncentrációja 33 mmól/liter legyen, és a keveréket egy órán át inkubáljuk szobahőmérsékleten. A mintákat erőteljesen dializáljuk TSN pufferral szemben. E. Rekombináns gD anyagok 1. ) Egy első megcsonkított glíkoproteint („ I—275 [ 1 ] “), amely az érett gD— 1 előrejelzett 1—275 gyökeit tartalmazza, állítunk elő a Lasky és munkatársai által leírt eljárással [Biotechnology, 2, 527—532 (1984)], mint a transzformált kínai hörcsög petefészek sejtek szekréciós termékeit, és tisztítjuk ezeket Eisenberg és munkatársai szerint [ J. Virol. 41, 1099—1104 (1982)] affinitáskromatográfiával. 2. ) Egy második megcsonkított glikoproteint („1—287 []]“), amely a gD»-! előrejelzett 1—287 gyökeinek és a HSV timidin kináz (TK) 48 karboxi-terminális gyökeinek fúziós termékét tartalmazza, állítunk elő Gibson és munkatársai által leírt eljárásokkal [J. Cell. Biochem, 8B. Kiegészítő kötet, (1984): Kivonatok a 13. Éves UCLA Symposiumokról (Abstract, 13"' Annual U.C.L.A. Symposia), N°. 1337, 191. oldal; valamint J. Virol. 48, 396—404 (1983)], mint vírussal fertőzött Hep—2 sejtek szekréciós termékeit. Röviden ismertetve, a vírus vektor tartalmazza a gD—1 gén egy megcsonkított 7 formáját (amely a gén SacI helyétől „fölfelé“ terjed ki a 287. gyöknél levő NarI helyig), amelyet beiktatunk a TK gén BglII helyébe. A fehérjét affinitás kromatográfiával tisztítjuk, MC Ab 11—436—1-et alkalmazva, amint ezt Noble és munkatársai leírják [J. Virol 129, 218—224 (1983)]. 3. ) Egy harmadik megcsonkított polipeptidet („8—300[í ] “), amely a 8.-tól mintegy 300.-ig terjedő gyököket tartalmazza, állítjuk elő E. coli-ban Watson és munkatársai általános módszere szerint [Science, 218,381—384(1982)]. 4. ) Egy fúziós polipeptidet („—5— 369[l]“), amely a gD—1 —5. helyzete és 369. helyzete közt terül el és a ß-galatkozidäz 11 amino-terminális gyökét tartalmazza, E. coli gazdasejtek transzformálásával nyerjük olyan M13 mp8 vírus-vektorral, amelybe előzőleg egy Ncol—NruII gD—1 génfragmenst iktattunk be Watson és munkatársa eljárása szerint (lásd fentebb) a vektorban jelen levő ß-galaktozidäz génen belül. F. Immuno-precipitáció és nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis (SDS—PAGE) A glikoprotein D-t HSV—I-el vagy HSV—2-vel fertőzött sejtek extraktumaiból (a sejteket 6 órán át fertőzzük), immunkicsapással nyerjük, antiszérumokat vagy MCAb-t és Staphylococcus aureus A fehérjét (IgG Sorb, New England Enzyme Center) alkalmazva. Az SDS—PAGE-t 10%-os akrilamid lapokon hajtjuk végre, amely akrilamid 0,4%-os N.N’-diallil-borkősav-diamiddal (DATD) végzett keresztkötésekkel van ellátva, amint ezt Eisenberg és munkatársai [J. Virol. 31, 608—620 (1979)] és Watson [Gene, 26, 307—312 (1983)] leírták. Az autoradiográfiához a géleket szűrőpapíron megszárítjuk és Kodak XAR—5 filmmel hozzuk érintkezésbe. A fluorográfiához a géleket Amplify nevű anyaggal (Amersham) kezeljük, szűrőpapíron szárítjuk, és Kodak XAR—5 filmre exponáljuk —70°C hőmérsékleten. G. Immunfolt- és semlegesítési vizsgálatok Az immunfolt vizsgálatokat úgy végezzük, amint ezt Cohen és munkatársai [J. Virol. 49, 102—108 (1984)] és Hebrink és munkatársai [J. Immunol. Methods, 48, 672-682 (1983)] leírták. A HSV—1-et (HF) vagy HSV—2-t (Savage) alkalmazó vírus-semlegesítési vizsgálatokat (50% tarfolt-csökkenési módszer) úgy hajtjuk végre, amint ezt Cohen és munkatársai leírták [J. Virol. 47, 172—181 (1978), és J. Virol. 10, 1021—2040 (1972)]. 2. példa Egér-egér hibridóma sejteket nyerünk a következő eljárás szerint. BALB/c egereket hiperimmunizálunk az 1. példa szerinti, affinitás kromatográfiával tisztított gD—1-el. 6ug kezdeti gD—1 dózissal intraperitoneálisan [lásd Long és munkatársai: Infect. 8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
