195247. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herpesz vírusokra fajlagos immunológiai anyagok előállítására és kimutatásukra
195247 Immun. 37, 761—764 (1984)]. Három nap múlva intravénás emlékeztetőt adunk, amely 1 pg immunogént tartalmaz, a lépeket eltávolítjuk és a sejteket BALB/c SP2/0 sejtekhez fuzionáljuk, PEG (polietilénglikol) fúzió elősegítő anyagot alkalmazva McKearn módszere szerint [Kennett és munkatársai: „Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension In Biological Analysis“ (Mono klonális antitestek, lúbridómák: új dimenzió a biológiai elemzésben) című munkájában, a 368—369 oldalon, Plenum Press kiadás, New York, New York ( 1980) |. A HAT kezelés után élő sejteket tartalmazó üregekből a feliilúszókat átvizsgáljuk gD-re fajlagos antitestek jelenlétére immunfolt módszerrel. A gD—l-re és gD—2-re pozitív sejteket szubklónozásnak vetjük alá, és a reprezentatív sejtvonalat, amely a „DL—6“ monoklonális antitestet termeli, elhelyezzük az ATCC-nél HB8606 letéti számon. A monoklonális antitesteket lehet izolálni négy pozitív sejtvonal növesztésének tenyészfolyadékjából, AMICON szűréses koncentrálással, amelyet ammónium-szulfátos kicsapás követ. Egy másik módszer szerint a koncentrált tenyészfolyadékot lehet abszorbeálni „A“ fehérje Sepharose oszlopon (Protein A Sepharose, Pharmacia Corp.). Megint másik változat szerint a monoklonális antitesteket lehet felerősített formában előállítani az ascites módszerrel, amint ezt általános módszerként Kennett és munkatársai leírták (lásd fentebb). Röviden ismertetve mintegy 3.106 -3.107 hibridóma sejtet injektálunk BALB/c egerek 0,25 ml Pristan-nal feltöltött peritoneális üregeibe. Az antitesteket az ascites folyadékokból ammónium-szulfátos kicsapással és DEAE Sephadexen lehet izolálni, amint ezt Eisenberg és munkatársai leírták [J. Virol. 41, 1099—1104 (1982)]. Annak érdekében, hogy immun-adszorbens oszlopokat készítsünk, izolált 2. ti pusú IgG antitesteket kapcsolhatunk össze cianogén-bromiddal aktivált Sepharose 4B oszlopokkal, tipikusan az 5—12 mg IgG/g Sepharose közti tartománynak megfelelő mennyiségekben, A tisztított antitesteket lehet jódozni ’‘3 * 5I-vel Greenwood és munkatársai klóramin—T módszere szerint [Biochem. J. 89, 114—123 (1963)] vagy, előnyösen, Liu és munkatársai laktoperoxidáz módszerével (lásd fentebb). 3. példa A DL—6 monoklonális antitestet előzetesen átvizsgáljuk tisztított gD elleni immun folt-elemzéssel és immunreaktívnak találjuk a natív és denaturált gD—1 és gD—2 ellen egyaránt, de nem találjuk immunreaktívnak az I—275 [1] rekombináns glikoprotein ellen. Ez azt jelzi, hogy a felismert, típusra közös epitóp nem az a szekvenciális epitóp (V. csoport), amelyről azt képzelték, hogy a gD—1 és gD—2 340. és 356. gyökei között van. 9 6 A gD—1 és gD—2 1.—23. gyökeinek másolatát jelentő szintetikus peptidekhez való kötődés hiányára alapozva, a (VII csoport) szekvenciális epitóp ebben a területben történő antitest felismerését kizárjuk. Az ATCC HB8606 tenyészfolyadékjában termelt és az ascites módszerrel felerősített DL—6 monoklonális antitesteket alkalmazzuk kiterjedtebb szűrővizsgálati eljárásokban, amint ezt a következő példában ismertetjük. 4. példa A DL—6 antitestet fluorescens antitestvizsgálatban vizsgáljuk fertőzött sejteken, és feltárjuk a típusra közös membrán immunfluoreszcenciát, amely jelzi hogy a felismert gD—I és gD—2 epitópok rendelkezésre állnak a glikoproteineken való kötéshez, amikor ezek bele vannak iktatva a sejtmembránba. A semlegesítési vizsgálatok (in vitro) feltárják, hogy a HSV—1 -el 1:50 hígításnál és HSV -2-vel 1:20 hígításnál semlegesítődik a DL—6 antitest, az 50% végpontot alkalmazva Eisenberg és munkatársai módszere szerint [J. Virol. 41, 1099—1104 ( 1982) ]. Immunfolt-vizsgálatot alkalmazunk az alábbi II. Táblázatban felsorolt szintetikus peptidek sorozatához való kötések átvizsgálására. Ebben a táblázatban a vizsgált peptidekben levő aminosav-szekvencíát az induló két számmal jelöljük és a zárójelben levő számok jelzik a szekvencia íajlagosságának típusát. A zárójelben levő H azt jelzi, hogy a szekvencia a vélt 1. típusú és 2. típusú szekvenciák hibridje. A II. Táblázat peptidjeivei végzett* immunfolt-vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy nincs immuno-reaktivitás a DL—6 és az (a) — (1) és a (p) peptidek között, de a DL—6 jelentős reaktivitást mutat az (m), (n) és (o) peptidekkel, amelyek a gD—1 és gD—2 266—279 gyökeinek és a gD—1 268—287 gyökeinek képviselői. Mivel a DL—6 immunfolt vizsgálatok feltárják, hogy a tunikamicin jelenlétében nőtt, HSV— 1 -el és HSV—2-vel fertőzött sejtekből nyert durva csapadékokban jelentős reaktivitás van jelen gD—1 -el és gD—2-vel, a DL—6 által felismert epitopban a szénhidrátok jelenléte kizárható. A DL—6 immuno-reaktivitását rekombináns módszerekkel termelt különböző D-glikoproteinszerü fragmensekkel és analóg anyagokkal immunfolt-módszerrel határozzuk meg. Amint korábban említettük, a DL—6 lényegében nem reaktív a Lasky és munkatársai eljárásával (lásd fentebb) előállított 1—275 [1] rekombináns glikoproteinnel. A DL—6 azonban immuno-reaktív minden olyan rekombináns termékkel, amely olyan aminosav-gyök szekvenciát tartalmaz, amely a gD—1 266. és 287. gyökei között terül el, 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
