195247. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herpesz vírusokra fajlagos immunológiai anyagok előállítására és kimutatásukra
195247 monoklonális antitest, amelyet az ATCC HB8606 hibridóma sejtvonal állít elő. Ez az antitest a következőkkel jellemezhető: (a) „A“ fehérjét kötő kapacitás; (b) HSV—1 és HSV—2 in vitro fertőzőképességének semlegesítésére szolgáló kapacitás; (c) fajlagos immunológiai reaktivitás természetben előforduló és rekombináns gD—1 és gD—2-vel, és kapacitás reverzibilis immuno-kötésekre ezekhez, természetes és denaturált állapotban egyaránt, akár glikozilezett, akár nem gl ikozi íezett formában; és ( d ) fajlagos immunológiai reaktivitás és kapacitás reverzibilis immun-kötésekre fehérje-szerű anyagokhoz, beleértve egy olyan aminosav szekvencia egészét vagy immunológiailag jelentős részét, amely a gD—1 és gD—2 előrejelzett, 266.j*287. közötti gyökeinek másolata, azaz i'l i \.....>. VI PFDPED S AI.LKDPV I vagy AJGTVAIvagy S). Az itt speciálisan DL—6 antitesttel immunreaktívnak jelzett fehérjeszerű anyagok között vannak a rekombináns módszerekkel termelt gD—1 fragmensek, mint pl. a transzformált E. coli sejtekben termelt „8—300 [1]” nem glikozilezett {ragmens, a Hep—2 sejtekben termelt glikozilezett „1—287 [ 1 ] ” fragmens, az E. coli sejtekben termelt“ —5—369 [1] “ termék, és az aminosavak polimerizálásával termelt „266— 279 [ 1 ] “, „266—279 [2]“ és „268—287 [1]“ szintetikus peptidek. A DL—6 antitesttel nem immunreaktívak a rekombinánsok által termelt gD 1 fragmensek, mint pl. a CHO sejtekben termelt „ 1 —275 [ 1 ] “ glikozilezett fragmens. valamint a gD—1 és gD—2 aminoterminális kezdő 23 gyöke különböző részeinek másolatát jelentő szintetikus peptidek és ezek „hibridjei“ és a „340—356 [1]“ szintetikus peptid, amely a gD—1 340. és 356. közti gyökei előrejelzett primer szerkezeti elrendezésének másolata. A DL—6 antitest alkalmazása a természetes forrásból eredő gD—1 affinitásos tisztításában nagyon hatásosnak bizonyul, az előzetesen meghatározott immunológiailag aktív gD—1 két-háromszoros termelését nyújtva ahhoz viszonyítva, mint amennyit korábban monoklonális anti-gD antitest készítményt alkalmazva nyertek. A fertőzött sejt eredetű, így izolált gD—I előzetes vizsgálatok szerint legalább olyan aktív protektiv immunogénként, mint a korábban izolált anyagok. Az alábbi példákon a találmány szerinti eljárás gyakorlati kivitelezését mutatjuk be az ATCC HB8606 hibridóma sejtvonal előállítására. Leírjuk az ezekkel a sejtvonalakkal termelt monoklonális antitestek jellemzőit, szaporírását és tulajdonságainak vizsgálatát, különös tekintettel az ATCC HB8606 hibridóma sejtvonal által termelt, jelenleg előnyös „DL—6“ antitest immunológiai tulajdonságaira és alkalmazására. Részletesebben, az 1. példa az utána következő példákban alkalmazott általános módszerekre és anyagokra vonatkozik. A 2. példá-5 4 ban ismertetett módszerrel egereket stimulálunk gD—1 elleni poliklonális antitestek termelésere; az egér lépsejtet egér mielóma-sejtekkel fuzionáljuk, és az ATCC HB8606 sejtvonalat tartalmazó hibridóma sejteket kiválasztjuk, klónozzuk és tenyésztjük. A 3. példa a négy fentebb jelzett sejtvonal által termelt monoklonális antitestek immun-reaktivitásának előzetes szűrővizsgálatára vonatkozik. A 4. példa a DL—6 monoklonális antitest részletesebb vizsgálatára vonatkozik, mely során részletesebben feltárjuk az antitest immunológiai tulajdonságait és azoknak az epitópoknak a természetét, amelyekhez ez kötődik. Az 5. példában a DL—6 antitestnek a természetes anyagokból származó gD—1 affinitásos tisztításában való alkalmazását írjuk le. 1. Példa A. Sejtek, vírusok és radioaktív jelzési eljárások A BHK és KB sejtek tenyésztéséhez és fenntartásában és a vírus szaporításában alkalmazott általános körülményeket a Cohen és munkatársai által leírtak szerint határozzuk meg [J. Virol. 14, 20—25 (1974) és J. Virol. 10. 1021—2030 (1972)]. A fertőzéshez 20 PFU (tarfolt-képző egység) mennyiséget alkalmazunk a HSV—1-nél (HF törzs) és 10 PFU-t a HSV—2-nél (Savage törzs). A HSV-vel fertőzött sejtek jelzéséhez alkalmazott eljárások [35S]-metioninnal (fajlagos aktivitás 600 Ci/mmól) és [2,3—3H]-argininnel (fajlagos aktivitás 15 Ci/mmól) azok, amelyeket a következő irodalmi helyeken írtak le: Cohen és munkatársai, J. Virol. 27, 172— 181 (1978); Eisenberg és munkatársai: J. Virol. 31, 608—620 (1979); Eisenberg és munkatársai, J. Virol. 41, 478—488 ( 1982) ; és Eisenberg és munkatársai: J. Virol. 35, 428— 435 (1980). B. Monoklonális antitestek Az összehasonlítási célokkal alkalmazott monoklonális antitestek („MCAb’s“) a következő példákban az alábbiak: MCAb HD—1 (I. csoport) és MCAb 170 (VII. csoport), amelyek a következő irodalmi helyek szerinti antitestek: Pereira és munkatársai: Infect, and. Immun. 35, 363—367 (1982) és Eisenberg és munkatársai. J. Virol. 41, 478—488 (1982); MCAb’s55S, 57 S (V. csoport), 11 S (III. csoport), 41 S (IV. csoport) és 45 S (VI. csoport), amelyek a következő irodalmi hely szerinti antitestek: Showalter és munkatársai: Infect, and Immun. 34, 684—692 (1981). C. Szintetikus peptidek Az antitestek peptidekkel való reaktivitásának a gD—1 és gD—2 1—23 helyzetein belüli gyökeire alapozott átvizsgálásában álkalmazott szintetikus peptideket a Cohen és munkatársai szerinti módszerrel állítjuk elő [J. Virol. 49, 102—108 (1984)]. A 340— 356 [1] szintetikus peptideket ciszteinnel, amelyeket az amino-terminálishoz adunk, és 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
