195234. lajstromszámú szabadalom • Eljárás luteinizáló hormont felszabadító hormont antagonizáló hatású nonapeptid és dekapeptid hormonanalógok és e vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
195234 19 20 9. lépés CH2Cl2-os öblítés, az 1-szer kapcsolási öblitoszer leöntese nélreakció 2 éra kül, kapcsolás 10. lépés CH2C12-os öblítés, adagolas 1-szer 1,5 perc 11 . lépés mosás CH2Cl2-nal 3-szer 1,5 perc 12. lépés mosás etanollal 3-szor 1,5 perc 13. lépés mosás CH2Cl2-nal 3-szor 1,5 perc Az 1-13. lépések alatt egy aminosav kapcsolási ciklusa játszódik le, a reakció lejátszódását Kaiser E, és munkatársai [Anal. Biochem. 34, 595 (1970)] ninhidrines eljárásával ellenőrizzük. A gyantát egymást követő lépésekben 2,0—2,5 mól feleslegben lévő aminosavakkal és DCC-vel kapcsoljuk. Ennek megfelelően, a gyantát az egymást követő kapcsolási ciklusokban 3,01 g Boc-Pro-OH-nal, 5,99 g Boc-Arg(tozil)-OH-nal, 3,49 g Boc-Leu-OH H20-nal, kezeljük. Ekkor a kapott tetrapeptid-gyantát kisebb adagokra osztjuk. Egy 1,0 g-os adaggal tovább folytatjuk az alábbi aminosavakkal a kapcsolási ciklusokat 0,456 g Boc-D-Dia-OH-toluolszulfonát 0,44 g Boc-Tyr (2,6-diklór-benzil )-OH, 0,375 g Boc-Ser(benzil)-OH, 0,315 g Boc-D-Nal (2)-OH, 0,35 g Boc-D-p-F-Phe-OH, 0,275 g Boc-L-prolin és 2,5 ml ecetsavanhidrid. A gyantát a reakcióedényből eltávolítjuk, diklór-metánnal mossuk és vákuumban szárítjuk. 1,66 g védett polipeptid-gyantát kapunk. A védett pepiidet szobahőmérsékleten 24 órán át tartó, 50 ml, 0°C-on ammóniával telített, metanollal végzett kezeléssel választjuk le a gyantáról. A gyantát leszűrjük és egymást követően metanollal és dimetil-formamiddal mossuk. A szűrletből az oldószert vákuumban eltávolítva 0,9 g védett pepiidet kapunk, sárga olaj formájában. A védőcsoportokat 10 ml vízmentes,cseppfolyós hidrogén-fluoriddal 1 ml anizol jelenlétében, Kel-F reakcióedényben 0°C-on, 30 percen át tartó kezeléssel távolítjuk el. A hidrogén-fluoridot vákuumban ledesztilláljuk, és a maradékként kapott N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D -Nal (2) -Ser-Tyr-D-Dia-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 -hidrogén-fluorid-sót éterrel mossuk. A maradékot ezután jégecettel extraháljuk. Az ecetsavas extraktumot liofilezve 0,5 g nyersterméket kapunk. A nyers pepiidet vízben acetátformában lévő Ag3X gyantával (gyengén bázikus tercier -amin gyanta) töltött oszlopon átvezetve acetátsóvá alakítjuk. Az eluátumot liofilezve 0,5 g nyers pepiidet kapunk, acetátsó formájában, fehér, szilárd anyagként. A nyers pepiidet nagynyomású folyadék-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, Licroprep Rp—18 (25-40 mikron) töltetű, 2,5 x 100cm-es oszlopon. Az oszlop ekvilibrálását 0,03 mól/ /I ammónium-acetátot tartalmazó 35% ciano-metánból és 65% vízből álló futtató pufferrel (pH 4,5) végezzük. A fő UV-abszorbeáló csúcsot (280 nm), mely a háromszoros oszlop- 15 térfogat közelében eluálódik, Szárazra pároljuk, és desztillált vízből háromszor lioíilezzük. 75 mg tiszta N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal (2) -Ser-Tyr-D-Dia-Leu-Arg-Pro-GlyNHj pepiidet kapunk ecetsavas só formájában [a]p5 = —15,4° (c=0,5 ecetsav). Hasonló módon eljárva, az A, B, C vagy F aminosavakat a fentebb megadott aminosavakkal helyettesítve az alább felsorolt megfelelő GlyNH2-dekapeptideket állítjuk elő: 25 N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal (2)-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Nal (2) -Ser-Tyr-D-Iph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, N-Ac-D-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Nal(2)-Ser- 3° -Tyr-D-Iph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Phe-Ser-Tyr--D-Iph-Leu-Arg-GlyNH2, N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-Trp-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, N -Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-T rp-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-GlyNh2, N-Ac- L-Pro - D-p - F-Phe- D-T rp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, N-Ac-L-Pro-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, N- Ac -L-Pro -D-p-F-Phe-D-T rp-Ser-Tyr-D-Prh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, 45 N-Ac-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D Trp-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, N-Ac-D-p-CI-Phe-D-p-Cl-Phe-D-T rp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, N-Ac-D-p-CI-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Irp-Ser-Tyr- 50 -D-Dph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, N-Ac-D-p-CI-Phe-D-p-Cl-Phe-D-T rp-Ser-Tyr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, N-Ac-D-p-CI-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, 55 N-Ac-D-p-CI-Phe-D-p-CI-Phe-D-T rp-Ser-Tyr-D-Prh-Leu-Arg-Pro-GlyNHj, N-Ac-Nal(2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dmh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, N-Ac-Nal (2) - D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D- 60 -Deh-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, N-Ac-Nal (2) - D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Dph-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, N-Ac-Nal (2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-Tvr-D-Dih-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, 65 N-Ac-Nal (2)-D-p-F-Phe-D-Trp-Ser-T\r-D-Dhh-Leu-Arg-Pro-GIyNHj,
