195005. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés hemoglobin kvantitatív meghatározására biológiai mintákban
195005 sékletnek elég magasnak kel! lennie ahhoz, hogy a reakcióelegyet elfolyósítsa és elfolyósítsa azt az anyagot is, amelyből a 12 mintavevő rúd készült. A hevítési lépés folyamán a reakcióelegy a székletmintával együtt, az elfolyósodott 12 mintavevő rúd és a hordozó közeg egyenletesen összekeveredik. A hevítési lépést követően ezt az egyenletesen összekeveredett elegyet lehűtjük és újra megszilárdítjuk. A leírt eljárás figyelembe vételével, amelyben a 12 mintavevő rúd folyékonnyá válik és egyenletesen összekeveredik a reagáló anyagokkal, a 12 mintavevő rúdnak bizonyos sajátosságokkal kell rendelkeznie, így például szilárdnak és merevnek kell lennie, legalább 50 C° hőmérsékletig és folyékonynak 100 C° feletti hőmérsékleten. Emellett tökéletesen összekevert állapotban kell maradnia a reagáló anyagokkal hűtés hatására is, és stabilnak kell lennie annyira, hogy a hevítés vagy a hosszabb ideig való tárolás normál körülmények között szobahőmérsékleten ne okozzon semmilyen jelentős változást kémiai vagv fizikai tulajdonságaiban. A 12 mintavevő rúd emellett olyan anyagból kell készüljön, amely vízben lassan feloldódik és elegyedik a kémiai reakcióeleggyel a 19a, 19b, 20a, 20b kamrában, amikor a hevítés során elfolyósodás következik be. Az is előnyös, ha a 12 mintavevő rúd olyan vegyületekből készül, amelyek hasonlók a reakcióelegyben levőkhöz, így például a polietilén-glikolokhoz; bár ez nem alapvető jelentőségű. A 12 mintavevő rúd ezen felül olyan anyagból kell készüljön, amely nem befolyásolja a hem komponens porfirinné alakulását vagy az ezt követő fluorimetriás mérést. Figyelembe véve ezeket a követelményeket, azt találtuk, hogy a 12 mintavevő rúd elsődlegesen olyan polietilén-glikolból készülhet, amelynek molekulasúlya kb. 20.000, vagy polietilén-oxiddal — amelynek molekulasúlya kb. 100.000, — vagy más polietilén-glikolokkal kombinálva, amelyek módosítják az anyag keménységét a kívánt mértékig. Amint azt korábban említettük, a 14 hüvely, amelyet a mintavétel után eldobunk, ugyanabból az anyagból készülhet, mint a 12 mintavevő rúd. Feltételezzük azonban, hogy számos más, a leírtakból eltérő molekulasúlyú elegy, mely az említett vagy hasonló vegyületekből áll, szintén megfelelő a 12 mintavevő rúd készítéséhez. Miután a székletmintát és a különböző reakcióelegyet a 19a, 19b, 20a és 20b kamrákban felmelegítettük, majd ezt követően lehűtöttük és újra megszilárdítottuk, mindegyik kamra tartalmát fluoreszcenciásan mérjük. Az eljárás általánosságban azonos azzal, amit a laboratóriumi eljárásnál ismertettünk, azzal az eltéréssel, hogy a folyadékokban a gerjesztő fényforrás áthatol a mintán, ha a fluoreszcenciát jobboldali szögből mérjük, míg szilárd anyag esetén a fluoreszcencia 15 mérését az ablakra merőlegesen kell végezni. A mérés során előnyösen a kontrollként alkalmazott vakpróba fluoreszcenciáját, a 19b és 20b kamrákban kivonjuk a megfelelő minta fluoreszcenciájából, amelyeket a 19a és 20a kamrában mértük. A fluoreszcencia szintek közötti így számított differenciát azután összehasonlítjuk egy ismert koncentrációjú hemoglobin sztenderd íluorészcenciás intenzitásával, és kiszámítjuk a vizsgálati minta hemoglobin tartalmát. Míg a fenti lépések utólag végrehajtott számítással is elvégezhetők, az előnyös foganatosítást mód esetén a fluoreszcenciás mérést, továbbá a vaKpróba fluoreszcenciájának kivonását a minta fluoreszcenciás intenzitásából és ennek a különbségnek a sztenderddel való öszszehasonlítását, továbbá a hemoglobin kvantitatív szintjének meghatározását automatikusan végezzük, egy megfelelően beállított mikroprocesszorral. így tehát a hűtés után (25 autokláv) a 18 berendezést eltávolítjuk a 24 borítékból (9. ábra), amelyben a vizsgálati mintát postára adták, és egy mozgó lemezre vagy 26 szállítószalagra vagy más megfelelő szállítóeszközre helyezve a fluoreszcenciás mérést elvégző 28 fluoriméterhez továbbítjuk. A 19a, 19b, 20a és 20b kamrák mindegyikében levő minták fluoreszcenciáját úgy határozzuk meg, hogy a mintákat megfelelő fényforrás (szűrő vagy monokrométer) hatásának tesszük ki, és egy fotodetektor rendszert alkalmazunk. Az egyes kamrákban mért fluoreszcencíás intenzitást azután közvetlenül betápláljuk a 29 mikroprocesszorba, ahol elemezzük, és a vizsgálati mintában levő hemoglobin térfogategységre eső mennyiségét kvantitatívan kiszámítjuk. (10. ábra). A leírt eljárás során bizonyos speciális elővigyázatossági intézkedések szükségesek a kamrák tartalmának közvetlen fluoreszcenciás mérésekor. Ezekre az elővigyázatossági intézkedésekre elsősorban a váltakozó veszteségek (»quenching«) miatt van szükség, amelyek a fluoreszcenciás intenzitást befolyásolják a közel ultraibolya fény (kb. 410 nm) exesszív abszorpciója miatt, amelyet általában a porfirin fluoreszcenciás gerjesztésére alkalmaznak. Ez a fényabszorpció felléphet akkor, ha különösen nagy mennyiségű porfirin, epefestékek vagy ételrészecskék, vagy más hasonló anyagok vannak jelen. így hacsak a mérést nem megfelelő elővigyázatossággal végezzük, nagymértékű quenching léphet fel. amely csökkenti a fluoreszcenciás intenzitást, és így a hemoglobin számított mennyisége kisebb lesz, mint az a mennyiség, ami valójában jelen van a székletmintában. Ez ellen úgy lehet védekezni — ha megfelelő műszer nem áll rendelkezésre —, hogy a reakciót folyékony közegben hajtjuk végre, és a próbát is hevítéssel olvasztjuk meg, A megmért aliquot részt azután eltávolítjuk, és 16 9 5 10' 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
