195005. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés hemoglobin kvantitatív meghatározására biológiai mintákban
195005 íluorimetriásan megmérjük megfelelő hígítást és/vagy extrakciót követően, ahogy azt a laboratóriumi eljárás során már leírtuk. Folyékony rendszerben az ún. »quenching« általában egy olyan probléma, amely egyszerűen megoldható az oldat további hígításával, és a íluoreszcenciás mérés ezt követő végrehajtásával. Ezt célszerűen automatizált rendszerben végezzük, de manuálisan is végrehajtható. Az automatizált rendszerben kb. 10—30 pl folyékonnyá tett oldatot adunk 100—300 pl 0,5 mólos oxálsavhoz. Ezt az elegyet azután összekeverjük és átengedjük egy keskeny mikrocellán fluorimetriás analízis céljára. A íluoreszcenciás gerjesztés hullámhossza látható fénynél a porfirin gerjesztési maximumánál kb. 555 nm-nél vagy 590—600 nm-nél célszerű, mivel az utóbbi hullámhosszak, — különösen az 590—600 nm-ig terjedő — viszonylag kismértékű nem specifikus fényabszorpciót mutatnak, és ezért elhanyagolható mértékű a fluoreszcenciás »quenching« az ilyen hígított mintákban. Ezek a hullámhosszak kisebb mértékű nem specifikus fluoreszcenciát gerjesztenek a széklet, vizelet és a félszilárd gélek előállítására használt hordozók alkotórészeiben is, mint az általában javasolt közel ultraibolya gerjesztési hullámhosszak. Számos más lehetőség is van, amely megfelel az automatizálás céljának. Ezek közül a legfontosabb a fluoreszcencia mérése közvetlenül az autoklávozott mintában, a fluoreszcenciás »quenching« — amely a fényabszorpció következtében lép fel — automatikus korrigálásával. Ez a komputer által végrehajtott korrekció azon alapul, hogy a fényabszorpciót és a fluoreszcenciát egyidejűleg határozzuk meg visszavert (vagy transzmittált) fény alkalmazásával és egy külön fotócsövet használva az abszorbanciás méréshez. A második derivált fluoreszcenciás spektrum alkalmazása vagy egy nem reagáló és nem fluoreszkáló pigment adagolása, amelynek fényabszorpciója nagymértékben meghaladja bármely más, a kamrában jelenlevő anyagét, szintén megfontolást érdemel. Az utóbbi esetben gyakorlatilag konstans fluoreszcenciás »quenching«-et lehet megfigyelni változó (és ekkor viszonylag elhanyagolható) mennyiségű székletpigment jelenlétében is. A fluoreszcenciás spektrum második deriváltjának alkalmazása jelentős előnyökkel járhat. A 11. ábrán az emissziós hullámhossz (nm) függvényben ábrázoltuk a hemoglobint tartalmazó minta (30 görbe) és a hemoglobint nem tartalmazó minta (31 görbe) fluoreszcenciás intenzitását. A hemoglobint nem tartalmazó minta csak a reagenseket tartalmazza (vakpróba). Ebben a fluoreszcenciás spektrumban a fluoreszcenciás intenzitás 550—700 nm-ig terjed, 408 nm gerjesztési hullámhossz mellett. Mint az látható a fluoreszcenciás intenzitás 608 nm hullámhossznál a 30 görbe szerinti mintára kb. 17 10 8200, összehasonlítva a 31 görbe szerinti vakpróba azonos hullámhosszon mért 4500 fluoreszcenciás intenzitásával. így a vizsgálati minta fluoreszcenciás intenzitása nem egészen kétszerese a vakpróba fluoreszcenciás intenzitásának. Bizonyos komputeres berendezésekkel azonban ennek a fluoreszcenciás spektrumnak a második deriváltja előállítható, és ez kiküszöböli a nem specifikus vakpróba fluoreszcenciáját. A 12. ábra a 11. ábrán látható fluoreszcenciás spektrum második deriváltját mutatja. Speciálisan a 32 görbe mutatja a 30 görbe második deriváltját és a 33 görbe szemlélteti a 31 görbe második deriváltját. A íluoreszcenciás spektrumoknak ezekben a második deriváltjában a fluoreszcenciás intenzitást úgy mérjük, mint egy különbséget a 31 és 30 görbe egymást követő minimumai a maximumai között, a 32 és 33 görbe vonatkozásában egyaránt. A 32 görbére nézve, amely hemoglobin tartalmú mintára vonatkozik, ez a különbség közelítően 4900, a különbség a pozitív értékben 587 nm-nél és a negatív értékben 604 nm-nél. A vakpróba esetén ez a különbség gyakorlatilag nulla. Ez a mérési módszer jelentősen javítja a vizsgálat pontosságát és érzékenységét. Bár az előnyös foganatosítási módokat részletesen ismertettük, számos változtatás és módosítás hajtható végre a módszeren és a találmány szerinti készüléken anélkül, hogy eltérnénk a találmány alapgondolatától, SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás hemoglobin kvantitatív meghatározására széklet-, vizelet, ill. gyomornedv mintákban, oly módon, hogy 1) a vizsgálandó székletből, vizeletből vagy gyomornedvből a hemoglobint meghatározott tömegben vagy térfogatban tartalmazó vizsgálati mintát készítünk, 2) a vizsgálati mintában lévő hemoglobin hem részét redukcióval porfirinné alakítjuk, majd megmérjük a minta fluoreszcenciáját, 3) egy korábban kimért fluoreszcencia-koncentráció diagram alapján a vizsgálati minta hemoglobin tartalmát meghatározzuk, azzal jellemezve, hogy az 1) eljárás után adott esetben egy vizsgálati minta részletet a hemoglobin hem részét porfirinné át nem alakító redukálószerrel, előnyösen citromsavval kezeljük 100— —150°C közötti hőmérsékleten, és a minta fluoreszcenciáját megmérjük, és a 2) eljárásban úgy járunk el, hogy a) a vizsgálati mintában lévő hemoglobin hem részét egy redukáló savval és egy redukáló sóval, előnyösen oxálsavval, ill. vas-oxaláttal vagy -szulfáttal 100—150°C hőmérsékleten kezelve alakítjuk porfirinné, kívánt esetben a vasionokat a mintából eltávolítjuk, majd megmérjük a minta adott esetben előkezelt felülúszó részének fluoreszcenciáját, vagy 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
