195005. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés hemoglobin kvantitatív meghatározására biológiai mintákban
195005 egyes csőbe vagy 1,0 ml felmelegített oxálsav-vas-oxalát elegyet, vagy ellenőrző elegyet adunk. A csövek tartalmát ezután jól összerázzuk, majd befedjük őket Saran-fedőkkel, amelyeknek lyukak vannak a tetején. A csöveket ezután autoklávban 90 percig 120°C hőmérsékleten tartjuk, majd hagyjuk szobahőmérsékletre hülni. A hűtést gyorsítani lehet hideg vízfürdőbe helyezéssel. Az etil-acetátos extrakciót vagy a centrifugálást, és a hígítást 0,5 mólos oxálsavval a korábban már leírt módon hajtjuk végre. Minthogy a protoporfirin adja a hemoglobin molekulasúlyának kb. 3,37 % -át, a porfirin mennyiségére kapott adatokat megszorozzuk 100/3,37-tel, azaz 29,67-dal, hogy megkapjuk a megfelelő hemoglobinmennyiség értékét. A székletmíntában a hemoglobin mennyiségét mg/g-ban úgy határozzuk meg, hogy az eredményt megszorozzuk a megfelelő hígítási faktorral. A találmány szerinti módszer automatizált változata során ugyanazokat az alapelveket alkalmazzuk, amelyeket az előbb ismertettünk. Bizonyos részleteket azonban megváltoztatunk, hogy megkönnyítsük a módszer nagyobb méretekben való alkalmazását. A laboratóriumi módszerhez hasonlóan az automatizált eljárás során is szükség van a vizsgálati minta összegyűjtésére a vizsgálandó biológiai mintából. A laboratóriumi eljáráshoz hasonlóan, az automatizált eljárást is példaként székletmintát véve ismertetjük. Az előnyös foganatosítási mód szerint a vizsgálati mintát az 1—5. ábrákon ismertetett mintavevő készülékkel gyűjtjük össze. Az ábrákon látható, hogy a 10 mintavételi eszköz egy megnyújtott, általában hengeres 12 mintavevő rúdból és 11 fogórészből, amelynek átmérője nagyobb, mint a 12 rúdé, áll. A 12 rúdrész a 11 fogórésszel kapcsolódik a 13 vállhoz. A mintavevő rúdrész egy 15 töréspontot tartalmaz, s ez lehetővé teszi, hogy a 1,2 mintavevő rudat két részre lehessen meghajlítani, miután a vizsgálati mintát öszszegyűjtöttük. A 12 mintavevő rúd alsó vége több 16 mintagyüjtő lyukat tartalmaz, amelyek a 12 mintavevő rúd szélénél helyezkednek el és a vizsgálati minta összegyűjtésére szolgálnak. A 10 mintavételi eszköz egy általában hengeres 14 hüvelyt is tartalmaz, amelynek belső átmérője kb. megegyezik a 12 mintavevő külső átmérőjével, így lehetővé válik, hogy a 14 hüvely rácsűsszon a 12 mintavevő rúdra, úgy, hogy csak kis rés maradjon közöttük. A 12 mintavevő rúd úgy van beállítva, hogy előre meghatározott székletminta mennyiséget vegyen. A 10 mintavételi eszköz működtetéséhez a 14 hüvelyt felemeljük úgy, hogy felső vége a 13 vállrészhez érjen, amint az a 2. ábrán látható. A 12 mintavevő rúd alsó végét ezután leengedjük a székleten keresztül egy pontra, amely közvetlenül a 14 hüvely alsó szintjénél van. Mia11 latt a 12 mintavevő rudat így leengedjük, egyszer vagy kétszer megforgatjuk, így biztosítva, hogy megfelelő mennyiségű minta kerüljön a székletből a 16 mintagyűjtő lyukakba. A 12 mintavevő rudat ezután kihúzzuk a székletből, és a 14 hüvelyt engedjük le az előbbi 12 mintavevő rúd helyén. Minthogy a 12 mintavevő rúd külső átmérője és a 14 hüvely belső átmérője között csak kicsi a különbség, a 12 mintavevő rúdról gyakorlatilag az összes székletet eltávolítjuk, kivéve azt, ami a 16 mintagyüjtő lyukakban marad. Miután a 14 hüvelyt eltávolítottuk, erre már nincsen szükség, és a 12 mintavevő rudat meghajlítjuk a 15 töréspontnál. A 12 mintavevő rúd alsó része, amint azt a 6. ábra mutatja, ezután egy 19a, 19b, 20a, 20b kamrába kerül, a 7. és 3. ábrán szemléltetett módon. A 7. ábra a 18 berendezést mutatja, amelyben számos 19a, 19b, 20a, 20b kamra van. Ezek a kamrák 21 fedővel vannak ellátva, amely rögzített. Mindegyik kamrához egy átlátszó 22 ablak is tartozik, amely eléggé áthatolható a fény számára 350 és 700 nm közötti hullámhosszon. Ez lehetővé teszi az anyag fluoreszcenciájának mérését a kamrán belül, közvetlenül a 22 ablakon át. Mint azt az alábbiakban részletesen ismertetni fogjuk, a 19a, 19b, 20a és 20b kamrák mindegyike részlegesen meg van töltve egy olyan reakcióeleggyei, amely egy redukáló savból és egy redukáló sóból, így például oxálsav-vas-oxalát reakcióelegyből, vagy egy kontrollelegyből, így pl. citromsavból áll. Az előnyös foganatosítási mód szerint, a 19a és 20a kamrákat úgy töltjük meg a reakcióeleggyel, hogy azokban oxálsavas és vasoxalátos kompozíció legyen, míg a 19b és 20b kamrák tartalmazzák a kontrollelegyet, azaz a citromsavas kompozíciót. Az elegyeket a 19a, 19b, 20a, 20b kamrákban érintkezésbe hozzuk a vizsgálati mintával. A 18 berendezés, amely a kamrákat tartalmazza, sok fajta anyagból készülhet, de előnyösen bármilyen vagy többféle műanyagból, amely a következő tulajdonságokkal rendelkezik. Először is a 19a, 19b, 20a, 20b kamrák, vagy legalább is a 22 ablakok, eléggé átlátszóak kell legyenek ahhoz, hogy a 350 és 700 nm közötti fény áthatoljon rajtuk és így megkönnyítsék a fluoreszcenciás mérést. Másodszor, az anyaguknak nem szabad reakcióba lépnie a reakciótér tartalmával vagy jelentősen befolyásolni a mérést bármilyen egyéb módon. Harmadrészt, az anyaguknak optikailag és kémiailag stabilisnak kell lennie 120C°-ra hevítve autoklávban vagy kemencében. A találmány szerinti eljárás következő lépése a vizsgálati mintában levő hemoglobin hem részének átalakítása fémmentes porfirinné. Mint ahogy fentebb a laboratóriumi eljárásnál leírtuk, ezt úgy hajtjuk végre, hogy a kamrákban lévő megfelelő elegyhez hozzáadjuk a vizsgálandó hígított anyag ho-12 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
