195005. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés hemoglobin kvantitatív meghatározására biológiai mintákban
(4:1 arányú elegy) és kb. 400 pl 3 mólos nátrium-acetáttal, majd centrifugáljuk. A felülúszó oldatot ezután fluoreszcenciásan mérjük. Ennek a módszernek az alkalmazása azért előnyös, mert így tisztított és gyakorlatilag színtelen oldatot kapunk, így specifikusabb és pontosabb fluoreszcenciás vizsgálat válik lehetővé. Ebben a rendszerben a nátrium-acetát szerepe az oxálsav részleges semlegesítése, egy részének nátrium-oxaláttá alakítása. A nátrium- és vas-oxalátok nagy része a csapadékban marad a centrifugálás után. A fluoreszcenciát megmérhetjük bármilyen szokásos és megfelelően érzékeny fluoriméterrel vagy spektro-fluorofotométerrel. Az előnyös foganatosítási mód során az eredményeket olyan spektro-fluorofotométerrel mértük, amelyeket az Aminco Bowman vagy Perkin Elmer gyártott. Speciális spektrumok, mint például a második derivált, a szinkron letapogatás és más hasonlók, a Perkin Elmer MPF—-44B készülékkel rögzíthetők. Minthogy az anyagban bizonyos mennyiségű, természetes eredetű fluoreszkáló anyag, beleértve a természetben előforduló protoporfirint és más porfirineket, van jelen, ennek a természetes, általában alacsony érzékű fluoreszcenciának a jelenlétével néha számolni kell. Ezért az eredmény pontosítása céljából kívánt esetben vakpróbát készíthetünk a vizsgálati minta egyik részletéből. A vakpróba fluoreszcenciájának mérése során azonban az oxálsavat és a vas-oxalátot 1,5 mólos citromsavval helyettesítjük, az eljárás egyebekben azonos. Azt találtuk, hogy a citromsav alkalmazása nem alakítja át a hem jelentős mennyiségét porfirinné (kevesebb, mint 0,2%-ot), így tehát, amikor ezt a vakpróba oldatot elkészítjük és fluoreszcenciáját megmérjük, a kapott intenzitás szinte teljesen a vizsgálati mintában természetesen jelenlevő porfirinektől és más anyagoktól származik. A jelenlévő hemoglobin kvantitatív meghatározására ezután a vizsgálati minta és a vakpróba fluoreszcencia értékét kivonjuk egymásból, majd egy előre kimért fluoreszcencia-koncentráció diagram alapján a minta hemoglobin tartalmát meghatározzuk. A fluoreszcenciás vizsgálat során a vizsgálati mintát gerjesztő fényforrás hatásának tesszük ki, és mérjük az emittált fluoreszcenciát. Az előnyös foganatosítási mód során (extrakció etil-acetáttal) akkor a legjobban értékelhető a fluoreszcencia, ha a gerjesztés kb. 401 nm-en történik. Három gyengébb gerjesztési csúcs található kb. 500 és 580 nm között, amelyek speciális körülmények között valamivel előbb léphetnek fel. Ezeknek a fluoreszcenciás csúcsoknak mindegyikével együtt a fluoreszkáló porfirin a székletmintában éles fluoreszcenciás csúcsot mutat kb. fi30 nm-nél. A fluoreszcenciás vizsgálat során ezen a hullámhosszon összehasonlítjuk a fluoreszcencia szinteket mind a vizsgálati minta — amelyben a hem átalakult fluoresz- 6 g káló porfirinné —, mind pedig a citromsavas minta etil-acetátos extraktumára. A különbséget ezután összehasonlítjuk a sztenderd értékével és meghatározzuk a hemoglobin koncentrációt. Ha az autoklávozott oldatokat oxálsavval hígítjuk, a gerjesztési hullámhossz 410 nm-nél van és fluoreszcenciát mérhetünk 660 nm-nél. A fluoreszcenciát savas oldatban 610 nm-nél is mérhetjük, de ez utóbbi hullámhossznál a specifikusság csökken. A 13. és 14. ábrák egy citromsavas elegy és egy oxálsav-vas-oxalát rendszer fluoreszcenciás spektrumát mutatják. A 13. ábrán a 34 görbe a hemoglobint tartalmazó oxálsav-vas-oxalát rendszer fluoreszcenciás spektruma, és a 35 görbe a hemoglobint tartalmazó citromsavas rendszer fluoreszcenciás spektruma. Így a 34 görbe mutatja a porfirinné átalakított hemoglobint. A 35 görbe alapján látható az igen kismértékű fluoreszcenciás intenzitásból, hogy a citromsavas rendszer jelentéktelen mennyiségű hemoglobint alakít át porfirinné. A 14. ábrán a 36 görbe az oxálsav-(vas-oxalát) rendszerben, míg a 37 görbe a citromsavas rendszerben oldott hemoglobin tartalmú székletminta fluoreszcenciás spektruma. A 36 görbe azt mutatja, hogy az oxálsav-(vas-oxalát) rendszerben minden hem vegyület átalakul, a kapott fluoreszcencia érték a minta hemoglobin tartalma és a jelenlévő természetes porfirin mennyisége öszszegére jellemző. A 37 görbe csak a természetes porfirinek fluoreszcenciáját, továbbá néhány nem porfirin természetű vegyület fluoreszcenciáját mutatja. így a 36 és 37 görbék szerinti fluoreszcencia különbség egy specifikus hullámhosszon az átalakított porfirin mennyiségére jellemző, amely a találmány szerinti eljárás értelmében egyenesen arányos a mintában levő hemoglobin hem tartalmával. A hemoglobin pillanatnyi kvantitatív értékét úgy határozzuk meg, hogy az adott hullámhosszon mért fluoreszcenciát összehasonlítjuk egy ismert mennyiségű hemoglobint tartalmazó minta ugyanazon a hullámhosszon felvett spektrumával. A leírt laboratóriumi eljárást például a következőképpen hajtjuk végre. Először is 2,5 %-os széklet homogenizátumot készítünk konyhasó oldatban. Ezután 100 g reakcióelegyet állítunk elő úgy, hogy 25,5 g oxálsavat, 1,0 g porított vas-szulfátot vagy vas-oxalátot és 73,8 ml vizet összekeverünk. Ezeket az alkotórészeket forró vízfürdőn hevítjük, hogy feloldódjanak és összekeveredjenek. A vas-oxalát nagy része oldhatatlan marad. A reakcióelegyet ezután szétosztjuk több csőbe, amelyeket lezárunk és —30 C’en tartunk felhasználásig. Előállítunk 100 g ellenőrző elegyet is, úgy, hogy összekeverünk 28,8 g citromsavat és 71,2 ml vizet. Ezután a 2,5 %-os széklet homogenizátum 50 pl-ét adjuk mindegyik csőhöz, amelyben a vizsgálatot végre akarjuk hajtani. Minden 10 195005 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
