195005. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés hemoglobin kvantitatív meghatározására biológiai mintákban
195005 8 oldattá keverünk össze. Bármelyik vas-só alkalmazása egyenes arányosságot teremt a mérhető fluoreszcencia és a hemoglobin koncentráció között egészen a legmagasabb vizsgált koncentrációig, nevezetesen 1620 pg hemoglobin per ml reagálandó oldat (kb. 50 pg hem/ml). A vas-szulfát alkalmazása azonban megnövekedett savassághoz vezet, mivel oxálsavhoz adva kénsavat és vas-oxalátot képez. A vas-szulfátot 20%-os vizes oldat formájában adagoltuk, amelyet frissen kellett készíteni, néhány órával az alkalmazás előtt, mert a vas-só oxidálódik. A vas-oxalát alkalmazása szintén jó linearitást eredményez, amenynyiben az gyakorlatilag tiszta (99 %-os). A vas-oxalátban levő szennyezések hátrányosan befolyásolják a reakció linearitását, alacsony hemoglobin koncentrációknál. Bár mind a vas-szulfát, mind pedig a vas-oxalát, éppúgy mint más vas-sók alkalmazhatók, a vas-oxalát alkalmazása előnyös. Az 1 %-os vas-oxalát oldat előállításához 1 g vas-oxalátot adunk 99 ml 2 mólos oxálsavhoz. A vizsgálati minta homogenizátumot ezután hozzáadjuk ennek az oldatnak egy részéhez és 90 percig 120C°-ra hevítjük. A reakció gyorsasága és teljes lejátszódása (a hem átalakulása porfirinné) a hőmérséklettel változik; így bár a 60—100 C° közötti hőmérsékleten is porfirinné alakul az elegyben levő hem, a reakció egészen lassan megy végbe. Általánosságban a hőmérséklet és a tartózkodási idő az autoklávban elég kell hogy legyen ahhoz, hogy a hem teljesen porfirinné alakulhasson. Bár az eljárás előnyös foganatosítási módja szerint 20 pl vizsgálati minta homogenizátumot 1000 pl oxálsav-vas-oxalát oldattal keverünk össze, számos más vizsgálati minta homogenizátum menynyiség alkalmazható, 5 pl és 100 pl között. Az oxálsav-vas-oxalát oldatot előre el lehet készíteni és —30C°-on tárolni. A redukáló sónak, ami a találmány szerinti eljárás előnyös foganatosítási módja esetén vas-oxalát, fontos szerepe van abból a szempontból, hogy jelenléte nagymértékben növeli a hemoglobin mérés lineáris jellegét, így a találmány szerinti eljárással, széles koncentráció tartományban válik lehetségessé a fluoreszcens porfirin kvantitatív mérése. A vas eltávolítása a hemoglobinból és így a hem molekula átalakítása protoporfirinné három tényezőtő) függ; a redukáló közegtől, erősen savas környezettől, és hőtől. A redukáló sav és elsősorban az oxálsav redukáló környezetet és savas körülményeket teremt. Ez egymagában alkalmas a hem eltávolítására a hemoglobin protein részéből, majd a vas eltávolítására a hem-ből, és ezáltal porfirinné alakítására. Azt találtuk azonban, hogy az oxálsav egymagában csak akkor hatásos ebben az átalakítási reakcióban, ha a hemoglobin koncentráció viszonylag kicsi, legfeljebb 15 pg/ml nagyságrendű az oxál7 sav oldatra nézve. Mivel a hemoglobin szint számos biológiai mintában, elsősorban a székletmintákban, ennek többszöröse lehet, az oxálsav vagy bármilyen más redukáló sav önmagában általában nem hatásos és ilyen nagy hemoglobin koncentrációknál nem alkalmazható, hacsak a hemoglobint nem hígítjuk több százszorosára vagy ezerszeresére. Nagyobb hemoglobin koncentrációk kvantitatív meghatározására a vas-oxalát vagy vas-szulfát additív redukáló szerként hat, növeli a redukáló körülményeket, ezáltal elősegíti az átalakulást és biztosítja, hogy a vizsgálati mintában levő hemoglobin hem-jének teljes mennyisége porfirinné alakuljon. Ez egy egyenes vonalú fluoreszcenciás görbét eredményez, amit az a 15. ábrán látható, amely egy bizonyos koncentráció tartomány felett alkalmas mindenféle lehetséges hemoglobin szint meghatározására biológiai mintákban, az ajánlott körülmények között. A 15. ábrán a hemoglobin koncentrációját mutatjuk be a fluoreszcenciás intenzitás függvényében vas-szulfát adagolása nélkül, illetve 0,1 %, 1,0% és 3,0% vas-szulfát adagolásánál. Amint az látható, a 39 görbe, amelyet vas-szulfát adagolás nélkül vettünk fel, nagyobb hemoglobin koncentrációknál nem lineáris. Ez a linéarités lehetővé teszi, hogy a hemoglobin koncentrációt a fluoreszcenciás intenzitás mérésével és egy sztenderddel való összehasonlításával határozzuk meg. A 15. ábrán a gerjesztési hullámhossz 410 nm, míg az emissziós hullámhossz 660 nm. Ezeket az autoklávozott mintákat a fluoreszcenciás vizsgálat előtt színtelenre hígítottuk. A laboratóriumi eljárás során előnyösnek találtuk olyan oxálsav oldat alkalmazását, amely kb. 0,1—5,0% vas-oxalátot tartalmaz; ez a hem teljes mennyiségét protoporfirinné alakítja abban a hemoglobin koncentrációban, amely azokban a biológiai mintákban előfordul, melyekre a találmány szerinti vizsgálatot alkalmazni célszerű. Különösen előnyös az 1,0 %-os vas-oxalát koncentráció alkalmazása. A hem protoporfirinné történt átalakítását követően az oxálsav és a vizsgálati minta elegyét hagyjuk lehűlni. Ezután megmérjük a fluoreszcenciát. Az elegy elkészítéséhez ehhez a vizsgálathoz két módszer is kínálkozik. Egyrészt az elegyet centrifugálhatjuk, a íelülűszó oldatot eltávolíthatjuk, 0,5 mólos oxálsavval hígítjuk és fluoreszcenciáját megmérjük. Ebben az eljárásban a csapadék vas-oxalátból és oldhatatlan székletmaradékból áll, míg a felülúszó oldat tartalmazza az összes, hemből képződött porfirint, továbbá kis mennyiségű széklet pigmentet, természetes porfirineket és némi vas-oxalátot. A másik — előnyös — eljárás során az oxálsav és a vizsgálati minta elegyét úgy készítjük elő a fluoreszcenciás méréshez, hogy abból kb. 100 pl-t veszünk ki, összerázzuk kb. 1200 pl etil-acetát:jégecet eleggyel 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
