195005. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés hemoglobin kvantitatív meghatározására biológiai mintákban
195005 6 A 3. ábra egy székletminta vételére alkalmas 10 mintavételi eszköz előlnézete. A 4. ábra egy székletminta vételére alkalmas 10 mintavételi eszköz keresztmetszeti képe a 3. ábra 4—4 vonalai mentén. Az 5. ábra egy székletminta vételére alkalmas 10 mintavételi eszköz keresztmetszeti képe a 3. ábra 5—5 vonala mentén. A 6. ábra egy 10 mintavevő' eszköz alsó részének előlnézete, amelyben a kivett minták a 16 mintagyűjtő lyukakban helyezkednek el. A 7. ábra a 18 berendezés képét mutatja, amelyben a vizsgálatot végrehajtjuk. A 8. ábra az egyik, 19a kamra belső részét mutatja, benne a 23 reakcióeleggyel és a vizsgálati mintával. A 9. ábra a 18 berendezést mutatja és a borítékot, amelyben az postára adható. A 10. ábra egy sematikus rajz, amely a találmány szerinti automata 18 berendezést mutatja. A W ábra egy gél reakcióelegy (oxálsav-vas-oxalát) fluoreszcenciás spektrumát mutatja hemoglobinnal (30. görbe) és anélkül (31. görbe). A 12. ábra all. ábrán látható fluoreszcenciás spektrum második deriváltját mutatja. A 13. ábra mutatja a hemoglobin spektrumát oxálsav és vas-oxalát elegyében, valamint a hemoglobin fluoreszcenciás spektrumát a cilromsavban. A függőleges tengelyen vannak a fluoreszcencia értékek, és a vízszintes tengelyen az emissziós hullámhosszok. A 14. ábra mutatja egy székletminta fluoreszcenciás spektrumát oxálsavas-vas-oxalátos eleggyel kezelve, és ugyanannak a mintának a spektrumát citromsavval kezelve. A függőleges tengelyen vannak a fluoreszcencia értékek, a vízszintes tengelyen pedig az emissziós huliámhosszok. * A 15. ábra mutatja az összefüggést a hemoglobintartalom és a fluoreszcencia között oxálsavas-vas-oxalátos oldatban vas-szulfát formájában adagolt vas jelenlétében. A hemoglobin koncentrációja látható a vízszintes tengelyen, és a fluoreszcencia értékek vannak feltüntetve a függőleges tengelyen. A találmány szerinti kvantitatív eljárás három alapvető eljárási lépésből áll. Az első lépés vizsgálati minta készítése a biológiai anyagból, amelyben kvantitatíven meg akarjuk határozni a hemoglobin szintjét; a második lépés a vizsgálati mintában levő hemoglobin nem fluoreszkáló bem részének kvantitatív átalakítása fluoreszkáló porfirinné; a harmadik, a porfirin, valamint a kontroll fluoreszcenciájának megmérése, és a fluoreszcencia különbség összehasonlítása egy kontroll sztenderddel, amelyet ismert hemoglobin koncentrációnál vettünk fel. A találmány szerinti megoldást kidolgoztuk laboratóriumi alkalmazásra is, folyékony rendszerben való fluoreszcencia méréssel, és automatikus formában is, szilárd rendszer5 ben fluoreszcencia méréssel. A laboratóriumi és az automata vizsgálat sok részlete különbözik, az alapelvek azonban azonosak. Kifejlesztettünk egy 10 mintavételi eszközt is a vizsgálati minták összegyűjtésére és előkészítésére az automatizált eljárásban. A 10 mintavételi eszközzel ismert mennyiségű székletmintát lehet biztosítani, akár a laboratóriumi, akár az automatizált eljárás részére. A laboratóriumi eljárás során a vizsgálati minta előkészítése első lépésként a vizsgálandó biológiai anyag begyűjtését, összekeverését és súlyának vagy térfogatának meghatározását foglalja magába. A találmány szerinti eljárás és berendezés számos különböző biológiai anyag vizsgálatára alkalmazható, különösen alkalmas azonban széklet- és vizeletminták esetében, így az előnyös foganatosítási módokat és kiviteli alakokat székletminta vonatkozásában ismertetjük. Először veszünk és megmérünk egy vizsgálandó székletmintát, amely például 0,5 gramm, Ezt a vizsgálati mintát azután hozzáadjuk kb. 20—40 térfogatnyi sóoldathoz, amely kb. 0,85 % nátrium-kloridot tartalmaz, az oldatot homogenizáljuk, hogy egyenletes székletdiszperziót kapjunk. A vizsgálati mintát azért keverjük össze sóoldattal, hogy a székletet — beleértve annak hemoglobin- és más pigmenttartalmát is — hígítsuk, és növeljük stabilitását. Ismeretes, hogy a hemoglobin alacsony koncentrációban stabilisabb sóoldatban, mint vízben. Előnyösnek találtuk az olyan széklet homogenizátumot, amely a vizsgálati mintából kb. 2,5—5%-ot tartalmaz, bár a minta mennyisége nem kritikus tényező. A leírt módon elkészített vizsgálati mintát fagyott állapotban, —15C°-------30 C° hőmérsékleten tárolhatjuk felhasználásig. Amikor a vizsgálat elvégzéséhez minden készen áll, az előkészített vizsgálati mintát összekeverjük egy bizonyos mennyiségű redukáló savval és redukáló sóval. Hevítés hatására a hemoglobin hem része porfirinné alakul. Bár más redukáló savak és sók is alkalmazhatók, redukáló savként előnyösen oxálsavat alkalmazunk, és redukáló sóként előnyösen vas-oxalátot vagy vas-szulfátot használunk. A fenti átalakítási reakció során a vasat eltávolítjuk a nem fluoreszkáló hem molekulából, így vasat nem tartalmazó, fluoreszkáló protoporfirint kapunk, amely az ultraibolyához közeli fény — hullámhossza kb 408 nm — hatására vörösen fluoreszkál. A protoporfirin akkor is fluoreszkál — bár kevésbé intenzíven —, ha zöld fény hatásának tesszük ki kb. 558 nm hullámhosszon, vagy ha sárga fénnyel világítjuk meg, kb. 600 nm hullámhosszon. Más hasonlóan fluoreszkáló porfirinek nyomnyi mennyiségei is képződhetnek. Az eljárás előnyös foganatosítási módja szerint 2 mól oxálsavat és megfelelő mennyiségű vas-oxalátot vagy vas-szulfátot 1 %-os 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
