195004. lajstromszámú szabadalom • A metasztatikus sejtakativitás meghatározására szolgáló eljárás
195004 4 vetdarabokat vagy sejteket általában in vitro 5 napig tenyésztjük, és a tápközeget naponta összegyűjtjük. A IV. típusú kollagenáz antigént tartalmazó tápközeg proteintjét ammónium-szulfáttal csapjuk ki, és több egymást követő' kromatográfiás oszlopra visszük fel, mint azt a kiviteli példákban leírjuk. A tisztított IV. típusú kollagenáz enzim móltömege 70 000 körüli érték, gélelektroforézissel vizsgálva két, 62 000, ill. 68 000 móltömegű polipeptid-láncból áll. A IV. típusú kollagenáz enzimet proteolitikusan aktiválni kell a maximális aktivitás elérése céljából, és pH optimuma 7,4. A IV. típusú kollagenáz enzim aktivitásának kifejtéséhez kalcium jelenléte szükséges. Az enzim specifikus, és nem bontja az I., II. vagy III. típusú kötőszövet kollagéneket, más alapmembrán komponenseket vagy kazeint. A IV. típusú kollagenáz enzim antigén elkülönítésével és tisztításával lehetőség nyílik a fenti enzim antigén specifikus antitestjeinek előállítására. Az ilyen antitestek előállítása lehetőséget termet a metasztatikus sejtaktivitás érzékeny immunológiai módszerekkel való mérésére a biológiai mintákban, például a testfolyadékokban, szövetextraktumokban, szövetmetszetekben, sejt- vagy szervtenyészetekben, tenyészközegekben a IV. típusú kollagenáz antigének kvalitatív vagy kvantitatív meghatározásával. Az antiszérumok, a poliklonális és monoklonális antitestek előállítására már korábban ismert módszereket használhatunk. Az antiszérum előállításra tisztított IV. típusú kollagenáz antigént többször szubkután injektáljuk kísérleti állatokba, például nyulakba vagy tengerimalacokba, és megfelelő idő elteltével a szérumot kivonjuk az állat (ok)ból. Az antiszérumban jelenlévő specifikus antitestek jelenlétét ismert módszerekkel, például enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA), a Western immunoelkenési technikával és immunológiai foltvizsgálatokkal határozhatjuk meg. Ezek a módszerek az adott területen jártas szakember számára jól ismertek. A murintípusú IV. kollagenáz antigén antiszérumának előállítására az általunk kidolgozott módszert alkalmazhatjuk. Az antiszérum reagál az egér antigénjével, mint azt az immunoelkenési, ELISA és immunofluoreszcens vizsgálatok mutatják. A hagyományos antiszérum előállítására a IV. típusú kollagenáz antigénnek nagytisztaságú és homogén proteinnek kell lennie. Különlegesen nehéz megfelelő mennyiségű, abszolút tiszta, humán IV. típusú kollagenáz antigént előállítani hagyományos antiszérum nyulakban vagy tengerimalacokban való előállítása céljából. A probléma megoldására Köhler és Milstein (Nature, 256, 496, 1975) módszerét alkalmaztuk monoklonális antitestek előállítására. Az eljárás előnye, hogy az antigénnek nem kell teljesen tisztának lennie, 3 mivel a specifikus antitestet termelő sejt kiónokat (hibrideket) in vitro körülmények között választhatjuk ki. A fentiekben ismertetett módszer szerint BALB/C egereket kétszer szubkután immunizáltunk 100 pg nagy tisztaságú IV. típusú kollagenázzal, melyet emberi fibroszarkómás sejtek tápközegéből nyertünk. Hat hét elteltével az antiszérumot az ELISA mó'dszer segítségével vizsgáltuk. Ha a kapott eredmények kielégítőek voltak, az egereket mégegyszer intravénásán immunizáltuk IV. típusú kollagenáz antigén megfelelő mennyiségével. Ezután két immunizált egér lépsejtjeit és egér mieloma sejteket (NS—1) hibridizáltunk és a hagyományos módszerrel mikrotiter lapokon tenyésztettünk. A 453 mintából 46 mutatott az antitestre nézve pozitív reakciót az ELISA módszerrel vizsgálva. A fentiekben ismertetett módszerrel 10 megfelelő hibrid vonalat kaptunk. Ez a 10 hibrid vonal nagymértékben pozitív volt rosszindulatú emberi fibroszarkóma és mell karcinoma sejtekre nézve, de csak gyengén reagáltak normális emberi bőr fibroblasztokkal. A 10-ből a 3 legnagyobb titerértékkel rendelkező hibrid sejtvonalat választottuk ki hígítási technikával végzett in vitro klónozásra, és monoklonális antitestek előállítására. A fentiekben ismertetett módon előállított, elkülönített és tisztított IV. típusú kollagenáz antigén monoklonális és poliklonális antitestjeit megfelelő radioaktív, enzimatikus vagy fluoreszcens jelekkel szokványos módon jelölhetjük meg, amely módszerek az adott területen jártas szakember számára ismertek. Ezeket a IV. típusú kollagenáz antigén elleni, poliklonális és monoklonális, jelzett és jelzetlen antitesteket megfelelő szilárd hordozókhoz köthetjük, és a találmány szerinti eljárásokban alkalmazhatjuk. A rosszindulatú, metasztatikus sejtaktivitással rendelkező sejtek kimutatására szolgáló módszereink szerint a IV. típusú kollagenáz enzim antigén jelenlétét biológiai mintákban, például testíolyadékokban, szövetextraktumokban és -metszetekben, stb. hagyományos immunológiai módszerekkel határozzuk meg jelzett vagy jelzetlen, kötött vagy megkötetlen IV. típusú kollagenáz enzim antigén készítmények, valamint jelzett vagy jelzetlen, kötött vagy megkötetlen, poliklonális vagy monoklonális antitest készítmények segítségével. Az immunológiai módszerekben nyúl antiszérumot használtunk a IV. típusú kollagenáz antigén jelenlétének meghatározására. Mint azt a Western elkenéses vizsgálat kimutatta, az antiszérum két proteint fest meg a 62 K és a 68 K területen, amely a tisztított IV. típusú kollagenáz enzim antigénnek felel meg. Továbbá az antiszérumot az emberi mellrák és normális mellszövetek immunológiai festésére is használtuk. A szövetek krioszekcióit először az antiszérummal, majd 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
