195004. lajstromszámú szabadalom • A metasztatikus sejtakativitás meghatározására szolgáló eljárás
195004 FITC-val (fluoreszecin-izotiocianát, Sigma gyártmány) konjugált anti-nyúl IgG-vel inkubáltuk. Az eredmények azt mutatták, hogy 10 normális szövetmintából egyik sem adott pozitív eredményt fluoreszcencia módszerrel vizsgálva, vagyis nem tartalmaztak IV. típusú kollagenáz antigént. Másrészt 25 mellrákos szövetmintából 25 intenzív fluoreszcenciát mutatott a tumor határának szélein. Ennek megfelelően a leírásban ismertetett immunológiai módszerek rosszindulatú tumorsejtek jelenlétét ki tudják mutatni a szövetekben, és mivel a festés elsősorban a tumor határoló részein volt látható, nyilvánvaló, hogy a IV. típusú kollagenáz antigén az elterjedési készséggel rendelkező sejtekben dúsul fel. Az emberi IV. típusú kollagenáz enzim antigén antitesteket, melyeket egér hibrid klónokból állítottunk elő, használtuk tenyésztett sejtek immunológiai megfestéséhez. A következő sejteket tanulmányoztuk: emberi fibroszarkóma (HT—1080), mellrák karcinoma sejtek (MFC—7) és normál emberi bőr fibroblasztok. A sejteket mikrotiter lapokon tenyésztettük antitestekkel együtt inkubálva, majd mostuk, és biotinilált ló antiegér IgG—IgM-mel inkubáltuk, majd megint mostuk. Ezután avidin-biotin-peroxidáz reagenst adtunk hozzá, hogy megfessük a sejtekhez kötött egér irnmunogiobulin-antiegér immunoglobulin komplexeket. Az eredmények azt mutatták, hogy a rosszindulatú HT—1080 és MCF-»-7 sejtek megfestődtek, míg a normális bőr fibroblasztok nem. így tehát nyilvánvaló, hogy az emberi, IV. típusú kollagenáz monoklonális antitestjei megfelelnek arra, hogy a IV. típusú kollagenáz enzim antigén tartalmú rosszindulatú sejteket megkülönböztessük az egészséges, a fenti enzim antigént nem tartalmazó normál sejtektől. A találmány szerinti megoldást az alábbi példákkal ismertetjük anélkül, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk. 1. PÉLDA A IV. típusú kollagenáz antigén izolálása A IV. típusú egér kollagenáz előállítására először metasztatikus PMT tumorokat (átültethető szarkoma, amely T241 fibroszarkomával rendelkező egér tüdöáttétjéböl származik) neveltünk C57B1/6J egerekben (fekete egerek /Jackson Labs. Bar Harbor, Maine, Amerikai Egyesült Államok). Kb. 2 hetes növesztés után a tumorokat kimetszettük, feldaraboltuk és szérummentes RPMI—1640 (Gibco Labs. gyártmány) közegben mint szervkultúrában inkubáltuk őket 5 napon keresztül. A tápközeget naponta összegyűjtöttük, és a proteintartalmát ammónium-szulfáttal (25—60 %-os telítettség) kicsaptuk. A csapadékot enzim-pufferben (0,05 M trisz-sósav; pH = 7,4; 0,2 M nátrium-klorid; 10 millimól/1 kalcium-klorid) oldottuk és concanavalin-A-agaróz (Sigma C6904 gyártmány) 5 4 oszlopon vezettük keresztül, így a legtöbb aktív enzimet megkötöttük. A megkötött enzimeket 1 M-os a-metil-mannoziddal eluáltuk, és egy agarózhoz kötött IV. típusú kollagént tartalmazó oszlopon vezettük keresztül. Az oszlophoz kötődött kollagént, amely érintetlen IV. típusú kollagén láncokat tartalmaz (185K és 175K), EHS-tumorból extraháltuk és tisztítottuk. Az EHS-tumor alapmembránt képez, amelyből IV. típusú kollagén extrahálható. Az EHS-tumor átültethető, murin petefészek tumor, amelyet először Swarm R. H. ismertetett »Transplantation of a murine chondrosarkoma in mice of different inbred etrains« című irodalmi helyen (J. Natl. Cancer, Inst., 31, 953—975 /1963/). A kollagén-agaróz enzim általi lebontását elkerülendő az oszlopon való átfutás ideje alatt a puffer kalcium-kloridtól mentes volt. Az aktív enzimeket az oszlopról 1 M nátrium-kloridot vagy 50 % etilén-glikolt tartalmazó enzim pufferral eluáltuk. Az enzim végső tisztítását molekulaszitán (Bio-Gel A, 0,5 m) végeztük, ahol az enzim kb. 160 000 látszólagos móltömeggel vándorol. A kapott tisztított enzim két, 68 K és 62 K móltömegű polipeptid-láncot tartalmaz. A IV. típusú emberi kollagenáz aktivitású enzimet, a murin enzim előállításához hasonlóan tenyésztett emberi fibroszarkóma sejtek (HT—1080) szérummentes tápközegéből állítottuk elő. A sejteket Dulbecco által módosított Eagleféle tápközegben (DMEM) tenyésztettük, amely 10%-os magzati szérumot is tartalmazó borjúszérumot tartalmazott. A tenyésztést hengeres üvegekben végeztük, majd a közeget ugyanolyan, szérummentes közegre cseréltük le. A közeget naponta, 5 napon keresztül gyűjtöttük. 2. PÉLDA A IV. típusú egér kollagenáz elleni antiszérum előállítása 100—200 pg fenti antigént egyenlő térfogatú foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) és Freund-féle komplett adjuvánssal, majd 4 hét elteltével Freund-féle inkomplett adjuvánssal szubkután injektáltuk egerekbe. 3 hetes időközökben ezután kétszer további injekciókat adtunk. 3 héttel az utolsó adag után a vért lecsapoltuk, és a szérumot specifikusság és titerérték szempontjából ELISA, Western elkenési és immunofestési technikák segítségével megvizsgáltuk. 3. PÉLDA Monoklonális antitestek előállítása és meghatározása BALB/C egereket 100 pg részlegesen tisztított, komplett Freund-féle adjuvánsban lévő, HT—1080 által termelt kollagenáz enzimmel immunizáltuk, és kétszer 50 pg ugyan- ' ilyen enzimmel reimmunizáltuk 3 hetes időközökben. Négy nappal később Köhler és Milstein (Nature, 256, 496, 1975) módszere 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
