195004. lajstromszámú szabadalom • A metasztatikus sejtakativitás meghatározására szolgáló eljárás
1 195004 2 A találmány tárgya eljárás a metasztatikus sejtaktivitás kimutatására IV. típusú kollagenáz antigén immunológiai meghatározásával a fenti enzim antigén poliklonális és monoklonális antitesteinek felhasználásával. A találmány további tárgya jelzett vagy jelzetlen antigént és a fenti antigén jelzett vagy jelzetlen poliklonális és monoklonális antitesteit tartalmazó készítmény. A rosszindulatú daganatos sejtek egyik fő jellemzője, hogy gyorsan terjednek és az elsődleges daganatos góc elsodródott sejtjeiből máshol új, másodlagos daganat alakul ki (metasztázia). Ennek megfelelően a terjedést folyamatok korai kimutatására és ellenőrzésére szolgáló eljárásoknak igen nagy a klinikai jelentőségük. . • A metasztázia kialakulása egymást kővető események komplexuma, amikor is a rosszindulatú sejtek elszakadnak az elsődleges tumorról, elözönlik a szomszédos szövetet, behatolnak a nyirok- vagy keringési csatornákba, egy távolabbi helyen a véredény falához kapcsolódnak és áthatolnak rajta, elözönlik a szövetet, és végül elszaporodnak és létrehozzák a metasztatikus fókuszt. A betörő rákos sejteknek számos helyen át kell hatolniuk az alapmembránokon a terjedési folyamat alatt. Az alapmembrán olyan extracelluláris állomány, amely folytonos, ellenálló réteget képez, elválasztva az epiteliális, endoteliális és parenchimális sejteket a sejtközi kötőszövettől. Ezek a membránok IV. tipusu- kollagénből és nem kollagén komponensekből, például lamininből, proteoglikanból, entaktinból és fibronektinből állnak. Az alapmembránok komoly akadályt jelentenek a rákos sejtek számára, ezért a lebomlásuk fontos lépcsőt jelent a metasztázis folyamán. Feltételezhető, hogy ezt a folyamatot a proteolitikus enzimek elősegítik. A proteázokról, például a plazminogen aktivátorokról, a katepszin B és D-röl és proteoglikan lebontó enzimekről leírták, hogy mind a rákos szövetek extraktumában, mind a tenyésztett rákos sejtek tápközegében egyaránt megnövekedett mennyiségben vannak jelen, és ezeknek az enzimeknek a révén szándékozták a sejtek elterjedési potenciálját mérni. Azonban az enzimek felszabadulása és a rosszindulatú sejtek elterjedési készsége közötti korrelációt nem sikerült igazolni. Valójában sokféle, elterjedési készséggel nem rendelkező sejtvonal termel plazminogén aktivátorokat. Továbbá, mivel a fentiekben említett proteázok nem bontják a IV. típusú kollagént, nem teremtenek megfelelő lehetőséget a rákos sejtek számára az alapmembránokon való áthaladásra. Kísérleteink során felismertük, hogy a rákos sejtek semleges proteázt termelnek, amely specifikusan bontja le a IV. típusú kollagént; és eljárásokat is kidolgoztunk ennek az enzimnek metasztatikus egér tumorból és tenyésztett emberi rákos sejtekből, homogén állapotban való előállítására (Liotta és társai. J. Natl. Cancer Inst., 58, 1427—1431, 1977; Liotta és társai, Proc. Natl. Acad. Sei. 76, 2268—2272, 1978; Salo és társai, The Journal of Biological Chemistry, 258, 3058—3063, 1983). Azt is kimutattuk, hogy ennek az enzimnek az aktivitása, amelyet a továbbiakban IV. típusú kollagenáznak nevezünk, a rákos sejtek metasztatikus potenciáljával korrelációban áll (Liotta és társai, Nature, 284, 67—68, 1980). Mivel bebizonyítottuk, hogy a IV. típusú kollagenáz enzim antigén megfelelő a metasztatikus természetű rosszindulatú sejtek kimutatására, az enzimnek nagy diagnosztikai jelentősége lehet. Azonban a IV. kollagenáz aktivitás mérése nem végezhető el biológiai folyadékokban, például testfolyadékokban, szövetextraktumokban vagy szövetmetszetekben, mivel az ilyen minták nagy menynyiségű proteáz inhibitort tartalmaznak. A találmány tárgya eljárás rosszindulatú, metasztatikus sejtaktivitással rendelkező tumorsejtek kimutatására a IV. típusú kollagenáz enzim antigén immunológiai meghatározásával biológiai mintákban, például testfolyadékokban, szövetextraktumokban, szövetmetszetekben, szerv- és sejtkultűrákban és tenyészközegekben. A találmány további tárgyát olyan készítmények képezik, amelyek jelzett és jelzetlen, nagymértékben tisztított IV. típusú kollagenáz enzim antigént és jelzett vagy jelzetlen, IV. típusú kollagenáz enzim antigén elleni poliklonális és monoklonális antitesteket tartalmaznak. A találmány megvalósításához nélkülözhetetlen, hogy eljárásokat dolgozzunk ki az alapmembránon áthatolni képes, különösen tumorsejtekben megtalálható IV. típusú kollagenáz enzim antigén tisztítására és azonosítására. Felfedeztük a IV. típusú kollagenáz antigént és módszereket dolgoztunk ki ennek az antigénnek a tisztítására és azonosítására (Liotta és társai, J. Natl. Cancer, Inst. 58, 1427—1431; Liotta és társai, Proc. Natl. Acad. Sei., 76, 2268—2272; Salo és társai, The Journal of Biological Chemistry, 258, 3058—63, 1983; Salo és társai, J. Bio. Chem. 1983). A IV. típusú kollagenáz aktivitás mérésére rádioaktivitással jelzett IV. típusú prokollagént használtunk szubsztrátként, amelyet korábban kidolgozott módszerünk szerint állítottunk elő (Tryggvason és társai, Biochemistry, 19, 1284—89, 1980). Ez az akiivitásvizsgálat szükséges ahhoz, hogy meghatározzuk a tisztítási eljárás különböző lépcsőiben a tisztasági fokot. Ezzel a módszerrel az enzimaktivitás szérummentes szervvagy sejttenyészet tápközegében meghatározható. A IV. típusú kollagenáz enzimet rosszindulatú tumorszövet szérummentes szervtenyészetének tápközegéből vagy tenyésztett tumor sejtek tápközegéből nyerhetjük. A szö5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
