194938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás javított nukleinsav-reagensek előállítására
194938 17 18 4. Táblázat (folytatás) Restrikciós fragmens Vektor Név Alkalmazás bi Pstl-PstI /0,6 kb/ M13mp7 mKTIII 277 Jelzett minta vizsgáló b2 Pstl-Clal /1,0 kb/ K13mp8 mKTH1278 Jelzett minta vizsgáló b3 BamHI-EcoRI /1,0 kb/ M13mp8 mKTH1279 Jelzett minta vizsgáló b.) Cytomegalovírusból származó nukleinsav-reagensek egy sorozata érzékenységének bemutatása szendvics- hibridizálási módszert alkalmazva A nukleinsav-reagensek sorozatának érzékenységét vizsgáljuk szendvics-hibridizálási módszerrel, összehasonlítva egy folyamatos reagens-párral. A minta a vizsgálatokhoz CMV DNS, amelyet 0,17 mól/literes NaOH oldattal 5 percen át forralunk, majd ez után az lb. példa szerint semlegesítjük. Olyan szűrő-5. Táblázat Minta Hibridizált radioaktivitás, (b)-vel^ molekula/vizsgálat mint vizsgáló mintával bx b2 b3 bx ,b2 bi*b2,b3 0 35 33 38 45 53 106 38 44 46 125 4 -10 6 85 135 142 205 292 1,6 * 10 7 203 254 265 415 645 két, amelyek mind 10n molekulát tartalmaznak mind egyszálúvá rendezett pKTH1273 (a,) DNS-ből, mind pKTH1274 (a2) DNS-ből, és a következő, 125I-vel jelzett, a 4. táblázatban felsorolt vizsgáló mintákat: mKTH1277 (b,), mKTH1278 (b2) és mKTH1279 (b?), alkalmazzuk a vizsgálatban. A vizsgáló minták mindegyike 10® cpm/pg DNS-t tartalmaz. A hibridizálási az lb. példában leírt mó- 2^ don hajtjuk végre. Az eredményeket az 5. táblázat mutatja be. bx 310.000 cpm/vizsgálat b2 320.000 cpm/vizsgálat b3 300.000 cpm/vizsgálat bx *b2 300.000 cpm mindegyikre/vizsgálat bx >b2,b3 300.000 cpm mindegyikre/vizsgálat Az alsó határérték a vizsgálatban, amelyet pozitívnak tekintünk, 51—55 cpm, amikor a vizsgáló minta b, vagy b2, vagy b3; 59 cpm, amikor a vizsgáló minta blt b2; és 63 cpm, amikor a vizsgáló minta b,, b2, b3. Az eredmények az 5. táblázatban azt mutatják, hogy a szendvics-hibridizálás, amelyben egyedi vizsgáló reagenseket alkalmazunk (b,, vagy b2, vagy b3) kimutat minden esetben 4* 106 CMV-DNS molekulát. Másrészt a b,, b2 vagy b,, b2, b3 reagenssel végzett hibridizálás kimutat már 10®molekula CMV-DNS-t is. Az eredmények azt mutatják, hogy a nukleinsav-reagensek sorozata négyszer érzékenyebb, mint az egyedi nukleinsav-reagensek. 65 c.) CMV diagnosztika szendvics-hibridizálást alkalmazva nukleinsav-reagensek sorozatával Klinikai mintákat vizsgálunk szendvics- 55 -hibridizálást alkalmazva reagensek sorozatával. Ezek a minták két vizeletmintát foglalnak magukba 1 év alatti gyermekekből. Ezekről a gyermekekről az a gyanú, hogy velük született cytomegália betegségben szenvednek. A paciensekből vett tüdő-biopsziás mintát tüdő CMV fertőzésre szintén megvizsgáljuk a jelen szendvics-hibridizálási módszerrel. Mind Cytomegalovírussal fertőzött, mind nem fertőzött humán embriósejteket is alkalmaztunk mintaként ebben a vizsgálatban. 10
