194938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás javított nukleinsav-reagensek előállítására
194938 Egy olyan oldatot, amely 1% szarkozilt, 5 mmól/liter EDTA-t és 200 pg borjú timusz DNS-t tartalmaz, adunk 10 ml vizeletmintához, amely után a vírusból kibocsátott DNS-t a hordozóval együtt kicsapjuk 10 ml izopropanolt alkalmazva szobahőmérsékleten. A kicsapott DNS-t 200 pl TE pufferban feloldjuk és egyszálú formába visszük át 5 percen át forralva, majd a DNS oldatot 0°C hőmérsékletre lehűtjük és hozzáadjuk a hibridizáló oldathoz. A tüdő-biopsziás mintát (néhány mm3) mechanikai úton aprítjuk késsel, 200 pl TE puffert, amely 1% SDS oldatot és 1 mg/ml K proteináz enzimet is tartalmaz, adunk hozzá. Emésztést hajtunk végre 37°C hőmérsékleten 1 órán át, amely után a mintát injekciós fecskendőbe húzzuk be kétszer egy vékony fecskendőn keresztül. Az így homogenizált mintát felforraljuk, majd hozzáadjuk a vizsgáló oldathoz. A Cytomegalovírussal fertőzött és nem fertőzött sejteket SDS-K-proteináz kezeléssel feltárjuk, homogenizáljuk és forraljuk, amint ezt fentebb leírtuk. A hibridizációs vizsgálatban a reagensek a pKTH1273(a,) és pKTH1274(a2) a szűrőkön és mKTH1277(b,), mKTH1278(b2) és mKTH1279(b3), mint vizsgálati minták, mindegyik 200 000 cpm/reakciókeverék jelzéssel. A hibridizálás további teendőit illetően a szűrők mosását és az eredmények számolását-az lb. példában leírtak szerint hajtjuk végre. A jelen hibridizálás eredményeit a 6. táblázatban mutatjuk be. 19 6. Táblázat Minta Hibridizált radioaktivitás Vírus-izolálás Fertőzött sejtek ( 105) 3521 Nem végeztük el 1 . vizelet (10 ml) 243 CMV 2. vizelet (10 ml) 3215 CMV Vizelet egy egészséges személytől ( 10 ml) 52 Nem végeztük el Tüdő-biopsziás minta 535 CMV 6. Táblázat (folytatás) 20 Minta Hibridizált radioaktivitás Vírus-izolálás Kontroll sejtek (105) 68 Nem végeztük el Minta nélkül 65 Nem végeztük el A 6. táblázatban levő eredmények azt mutatják, hogy lehetséges nukleinsav-reagensek sorozatának alkalmazásával CMV-t kimutatni különböző klinikai mintákban, mint pl. \ izeletben, tüdő-biopszia mintákban és sejtekben. A vizsgálat fajlagos Cytomegalovírusra; ez nem azonosítja a humán DNS-t, vagyis a vizsgálatot a mintában jelen levő humán DNS nem befolyásolja. Valójában a minta típusa semmiképpen nem befolyásolja a vizsgálat fajlagosságát. 3. példa a) Nukleinsav-reagensek sorozata Herpes simplex 1. és 2. típusú vírusból, és ezek készítése Herpes simplex 1. és 2. típusú vírus (HSV1 és HSV2) diagnózisához alkalmas DNS fragmenseket készítünk az American Type Culture Collection-nál rendelkezésre álló vírus DNS- ekből (ATCC VR-733 és ATCC VR-734). Herpes simplex vírus 1. típus HSV1 DNS-t izolálunk és emésztünk Hindii! restrikciós enzimmel ismert módszerek szerint, az így létrejövő Hind 111 fragmenseket pBR322 plazmidba klónozzuk, és a rekombinánsokat Escherichia coli K12 HB101 gazdaszervezetbe visszük át ismert módszerekkel. Reagens-előállításhoz egy 8,5 kb-os HindlII fragmenst választunk ki, ezt pKZH 1359-nek nevezzük. A pKTH1359 alkalmasságát közvetlen hibridizálási vizsgálattal vizsgáljuk meg. A pKTH1359 mutat bizonyos keresztreakciót HSV2-vel, de más vizsgált nukleinsavakkal nem. A szubklónozást ismert technikákkal hajtjuk végre, vektorként a pBR322 és pBR325 plazmidokat és az M13mpl0 és M13mpll fágokat alkalmazva. A 14. ábra mutatja be a pKTH1359 rekombináns plazmidot és az EcoRI, PstI, HindlII és BamHI restrikciós enzimek alkalmazásával kapott fragmenseket, valamint ezek relatív méretét és egymáshoz viszonyított elhelyezkedését. A két PstI fragmens belső sorrendjét nem határozzuk meg. 1 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
