194938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás javított nukleinsav-reagensek előállítására
194938 náns plazmid, a pBR 325 plazmid vektorban magában foglalja az AD 169 citomegalovírusból származó DNS-t. Ezt a rekombináns plazmidot klónozzuk az Escherichia coli K .12 HB101 gazdaszervezetbe, a pKTH 1220 és pKTH 1271 rekombináns plazmidokat tartalmazó gazdasejtek a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen tenyészet-gyűjteményben (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, Nyugat-Németország, letétbe vannak, helyezve. A pKTH 1220 rekombináns plazmidot tartalmazó törzs letéti száma DSM 2825 és a pKTH 1271 rekombináns plazmidot tartalmazó törzs letéti száma DSM 2826. A letétbe helyezett törzsek szabadon rendelkezésre állnak, amint a szabadalmi bejelentés nyilvánosságra kerül. A találmányt nagyobb részletességgel írják le a következő példák. Ezeket a példákat azonban nem szabad úgy felfogni, mint a találmány oltalmi körét korlátozó tényezőket. A nukleinsavak (DNS és RNS) szerkezete hasonló, a szóban forgó nukleinsav akár prokarióta, akár eukarióta sejtből származik. Ez okból a példákban bemutatott elvek egyaránt jól alkalmazhatók az állati (embert is beleértve) nukleinsavakhoz és a növényi mikrobiális vagy vírus nukleinsavakhoz. A nukleinsav-fragmensek sorozatait szintetikusan is elő lehet állítani. Az azonosítandó nukleinsavak szekvenciáját jellemezni lehet és fragmensek homológ sorozatait lehet előállítani automatikus nukleinsav-előállító berendezésekkel. I. példa a.) Nukleinsav reagensek sorozatai Chlamydia trachomatisból, és ezek előállítása A Chlamydia trachomatis csoport diagnosztikájához megfelelő DNS fragmenseket állítunk elő Chlamydia trachomatis L 2 szerotípus DNS-éből. A DNS izolálását és fragmensekre bontását ismert módszerekkel végezzük, és az így létrejött DNS fragmenseket 11 pBR 322 plazmidba klónozzuk és átvisszük Escherichia coli K 12 HB101 gazdaszervezetbe ismert módszerekkel. A Chlamydia trachomatis L2 baktériumnak egy gén-bankját 5 nagyszámú rekombináns plazmid klónozása eredményeként nyerjük, amely plazmidok mindegyike Chlamydiákból származó DNS elkülönített BamHI restrikciós fragmenseivel rendelkezik. A reagensek előállításához a 10 Chlamydia eredetű DNS-ből származó maximálisan nagy DNS beiktatásokat tartalmazó rekombináns plazmidokat választjuk ki a gén-bar\kból. Egy ilyen plazmid a pKTH 1220- -nak nevezett plazmid, amely a Deutsche- 15 Sammlung von Mikroorganismen tenyészetgyűjteményben DSM 2825 számon van letétbe helyezve, és amelynek alkalmasságát a reagensként való felhasználáshoz egy közvetlen hibridizálási vizsgálattal mutatjuk be. A vizs- 20 gálát kimutta, hogy a pKTH 1220 azonosította az összes, különböző Chlamydia trachomatis szerotípusokból származó nukleinsavakat, te más nukleinsavakat nem. A különböző restrikciós enzimeket alkal- 25 mazva nyerhető, alkalmazható fragmenseket a pKTH 1220-plazmid DNS-ből választjuk ki, és ezek közül a fragmensek közül néhányat átviszünk további klónozásra pAT153 plazmidba (Maniatis és munkatársai: Molecular 30 Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982) 6. oldal), és néhányat M 13 fágba. A 10. ábra mutatja be a pKTH 1220 rekombináns plazmidot, amelynek molekulahossza 14 kb. A 10. ábrában 35 BamHI, Sail és Clal jelenti az alkalmazott restrikciós enzimeket, és a,, a2, b,, b2 és b3 mutatja az ezeknek a restrikciós enzimeknek a segítségével termelt fragmensek méretét és kölcsönös elhelyezkedését. A b szériához 40 tartozó fragmensek a jelzett vizsgálati minták. Az 1. táblázat sorolja fel a további klónozáshoz alkalmazott vektorok és fragmensek méretét, a rekombináns plazmidok nevét, és ezek felhasználását. 12 1 . Táblázat Fragmens Méret Vektor Rekombináns plazmid Alkalmazás ai Clal-Sall 3,0 kb PAT153 pKTH1252 Szűrő a2 Sall-Clal 2,9 kb pAT153 pKTH1250 Szűrő bi SalI-BamHI 0,7 kb M13mp8 mKTH1242 Jelzett vizsgáló minta b2 BamHI-Sall 1,4 kb M13mp8 mKTH1239 Jelzett vizsgáló minta b3 Clal-Clal 1,7 kb M13mp8 mKTH1248 Jelzett vizsgáló minta bi~b2 BamHI-BamHI 2,1 kb M13mp8 mKTH1245 Jelzett vizsgáló minta Az 1. táblázatban felsorolt fragmenseket agaróz gélről izoláljuk elektroelúcióval és klónozzuk az 1. táblázatban felsorolt vektorok alkalmas restrikciós enzim-azonosítási helyeire, ismert módszereket alkalmazva. A 2,1 kb-s BamHI-BamHI fragmenst a következőképpen állítjuk elő: a pKTH 1220 plazmid 1,4 kb-s BamHI-Sall és 0,7 kb-s S a 11 - -BamHI fragmenseit elkülönítjük agaróz gél- 65 ben végzett gélelektroforézissel, amelyből 7
