194938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás javított nukleinsav-reagensek előállítására
194938 14 ezeket izoláljuk. A tisztított fragmenseket egyesítjük egymással T4 ligáz enzim segítségével, és a reakcióban előállított 2,1 kb-s DNS-ből azokat, amelyeknek olyan szabad végeik vannak, amelyek BamHI enzimmel azonosítottunk, tovább egyesítjük M13mp8 tág DNS kétszálú formájának BamHI restrikciós helyeihez. így egy rekombináns fág-DNS-t készítünk (mKTH1245), amely tartalmazza a Chlamydia trachomatis DNS-t; ez két elkülönített DNS fragmensből áll, amelyek nem szomszédosán vannak elhelyezve a genomban. A genomban azonban ezek a szűrőhöz rögzítendő pKTH1250 és pKTH1252 DNS reagensekkel szomszédosán helyezkednek el (11. ábra). All. ábra bemutatja a szendvics-hibridek egy sorozatát, amely akkor képződik, amikor az 1. táblázatban felsorolt rekombináns plazmidokat és rekombináns fágokat alkalmazzuk, mint nukleinsav-reagensek sorozatait. b.) Chlamydia trachomatisbó) származó nukleinsav reagensek egy sorozata érzékenységének bemutatása szendvics-hibridizálási módszert alkalmazva A nukleinsav-reagensek sorozatának érzékenységét tanulmányozzuk szendvics-hibridizálási módszerrel, összehasonlítva egyedi 13 folyamatos reagens-párral. A vizsgálatot olyan szűrőket alkalmazva hajtjuk végre, amelyek mind 10" molekulát tartalmaznak egyszálúvá rendezett mind pKTH1250(a2)-ből, 5 mind pKTH1252(a,)-ből. A tanulmányozandó minta a pKTH 1220 plazmid, amely a vizsgálathoz egyszálúvá van rendezve 5 perces forralással 0,17 mól/literes NaOH-ban, amely után ezt átvisszük 0°C hőmérsékletre és sem- 1C iegesítjük ekvimoláris mennyiségű ecetsavval. A következő, l25I-vel jelzett, 1. táblázatban felsorolt vizsgálati mintákat alkalmazzuk a vizsgálatban: mKTH1242(b,), mKTH1239 (b2), mKTH1248 (b3), és mKTH1245(b,-b2). 15 A hibridizálást +65°C hőmérsékleten hajtjuk végre 17 órán át hibridizáló oldatban, amelynek az összetétele a következő: 4-szeres SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% polivi- 20 nilpirrolidon, 0,2% SDS (nátrium-dodecil-szulfát) és 200 pg/ml hering-sperma DNS. A szűrőket 2 órán át mossuk 50°C hőmérsékleten mosó oldattal, amelynek összetétele a következő: 0,1-szeres SSC, 0,2% SDS, és 25 megszámláljuk gamma-számlálóval. Az eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be, ezek öt párhuzamos vizsgálat eredményeinek átlagát mutatják. 2, Táblázat Mintamo 1ekula/ Hibridizált val radioaktivitás, (b)-vel, mint vizsgálati mintávizsgálat bi b2 b3 bi ,b2 (bi~b2)(bi~b 2) j b3 0 37 37 33 49 39 52 106 48 44 48 J 93 68 140 107 226 236 232 396 416 686 108 1475 1415 1456 2912 2637 3580 bi 380,000 cpm/vizsgálat; 5.107 cpm/jug DNS b2 340,000 cpm/vizsgálat: 4.107 cpm/jHg DNS b3 350,000 cpm/vizsgálat; 5 -107 cpm/jug DNS bi~b2 bi ,b2 (bi-b2),b3 310.000 cpm/vizsgálat; 700.000 cpm/vizsgálat; 700.000 cpm/vizsgálat; 7 * 10 7 cpm/jug DNS Statisztikailag kalkulálva minta nélkülvég. rehajtott (negatív kontroll) vizsgálatok 95%-os biztonsági (konfidencia) határát tekintjük a pozitivításhoz alsó határnak. Ezek az értékek, amikor a vizsgáló minta b,, b2 vagy b3, 52—54 cpm; amikor a vizsgáló minta b,, b2, 58 cpm; amikor a vizsgáló minta b,-b2, 56 cpm; és amikor a vizsgáló minta b,-b2, b3, 65 cpm. c.) Chlamydia diagnosztika szendvics-hibridizálást alkalmazva nukleinsav-fragmensek sorozatával Három férfitől, akik urethritisben szenvednek és három nőtől, akik cervicitisben szen-8 vednek, mintákat veszünk a vizsgálathoz. Chlamydia trachomatist izolálunk a férfi húgy- 55 csövekből és a női méhnyakból vett mintákból. Ezen kívül megfelelő hasonló páciensből vett mintákat is tanulmányozunk, akikből Chlamydiát nem tudunk izolálni. A vizsgálandó mintákat gyapottal fedett tamponokkal gQ vesszük, amelyeket Chlamydia mintavevő pufferba merítünk, amely puffer 0,2 mól/liter szacharózt, 20 mmól/liter foszfát-puffért, 3% borjúembrió szérumot, 10 pg/ml gentamicint, 100 pg/ml vankomicint, és 25 nemzetközi egység/ml nisztatint tartalmaz. A Chlamydiát a mintákból tenyésztjük.
