194938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás javított nukleinsav-reagensek előállítására
194938 fásához szendvics-hibridizálási módszerekkel. A mintát olyan módon kezeljük, hogy a nukleinsavakat a hibridizáló oldatba bocsátjuk, és azokat egyszálúvá tesszük. A hibridizálást egy hibridizáló oldatban hajtjuk végre, amelyhez hozzáadjuk mind a szilárd hordozóhoz rögzített nukleinsavat, mind a jelzett nukleinsavat. Amikor a hibridizálás végbement, a szűrőket kiemeljük a hibridizáló oldatból, ha szűrőt alkalmazunk szilárd hordozóként. Ha kromatográfiás mátrixot, látexet vagy hasonlókat alkalmazunk, a hibridizáló folyadékot távolítjuk el. A szilárd hordozót egy megfelelő mosó oldattal leöblítjük. A képződött szendvics hibridek sorozatát (8a, 8b, 8c ábrák) ismert módszerekkel mutatjuk ki. A radioaktív jelzést pl. autoradiográfiával, vagy szcintil 1 ációs számlálóval, vagy gammaszámlálóval mérjük. Egy enzimes jelzést pl. egy színreakció kialakulása után fotometriásan mérhetünk, vagy csapadékképződés alapján. A lantanid-kelátokat egy úgynevezett „idő felbontó fluoreszcencia" (time resolved fluorenscence) módszerrel mutathatjuk ki. Egy immunológiai jelzést a célnak megfelelő immunológiai módszerekkel mutathatunk ki. Több különböző keveréket lehet alkalmazni hibridizáló oldatként; a 79, 139 lajstromszámú európai és 4, 302, 204 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban bemutatott változatokat a példákban is megemlítjük. Természetes, hogy lehet alkalmazni más hibridizáló keverékeket is. A hibridizálás 0—80°C hőmérsékleten megy végbe, de előnyös pl. 65°C hőmérsékletet alkalmazni. Megfelelő hibridizálás mehet végbe igen rövid idő alatt is, de előnyös pl. 12—20 óra hibridizálási időt alkalmazni. A két-lépéses szendvics-hibridizációs módszert elvileg azonos módon hajtjuk végre, de ebben az esetben a szilárd hordozóhoz rögzített nukleinsav-reagenst adjuk először a hibridizáló oldathoz. Amikor a hibridizálás végbement, a szilárd hordozót mossuk és második hibridizálást hajtunk végre, amelyben a jelzett nukleinsav-reagens van jelen. A fentebb leírt jelzett nukleinsav-reagenseket vagy A*, Ay, Az, stb. és B*, Bÿ, B*, stb. reagens-kombinációkat természetesen lehet alkalmazni közvetlen hibridizálási módszerekben is. Ilyen esetben egy oldatban levő nukleinsav mintát az azonosítandó x, y és z nukleinsavhoz szét kell osztani, vagy ha a minta szilárd hordozóhoz van rögzítve, külön-külön, hordozóhoz rögzített mintát kell készíteni minden egyes mintához. A hibridek így képződött sorozatát (9. ábra) ismert módszerekkel lehet kimutatni. A 9. ábrában F jelenti a szilárd hordozót, azaz a szűrőt, x jelenti az azonosítandó nukleinsavat, és v jelenti a vektorból származó részeket. Az alkalmazott jelzett vizsgáló minták az a,, a2, és a3 (9a. ábra), b, és b2 (9b. ábra) és a,, b,, a2, b2, a3 (9c. ábra). 9 6 Amint ezt már fentebb leírtuk, a nukleinsav-reagensek különböző kombinációit készíthetjük el a találmány szerinti nukleinsav-fragmensék sorozatából. Lehetséges ezeket a kombinációkat alkalmazva azonosítani több különböző nukleinsavat egyidejűleg. Az azonosítandó különböző nukleinsavakra homológ nukleinsav-fragmensek sorozatát lehet használni elkülönített fragmensekként a keverékben, vagy egymással egyesítve olyan módon, hogy egy, több különböző nukleinsavat azonosító vizsgáló mintát nyerünk. Szilárd hordozóra kötött nukleinsav-reagenseket természetesen elkülönítve kell tartani abból a célból, hogy az azonosítás sikeres legyen. A nukleinsav-fragmensek sorozatát alkalmazó hibridizálást lehet használni humán-, állat- és növénypatogén mikroorganizmusok azonosítására. A módszerrel lehet azonosítani élelmiszerekben jelen levő mikroorganizmusokat, mint pl. Clostridiumokat, Salmonellákat, Staphylococcusokat, amelyek élelmiszermérgezést okoznak. A módszer alkalmas a vízben levő fertőzések, pl. enterobaktériumok és enterovírusok azonosítására. Mivel a nukleinsav fragmensek sorozatát alkalmazó szendvics-hibridizáló vizsgálat kvantitatív módszer, ez alkalmazható pl. a gén-sokszorozódás kimutatására és mérésére is. Ez a jellemző fontos pl. a rák kimutatásában és mérésében. Hibridek stabil sorozatának képződéséhez az szükséges, hogy a vizsgáló minta reagens és a szűrő-reagens homológ szekvenciái egy mérsékelt, előnyösen kevesebb, mint 5 kilobázis (kb) távolságon belül legyenek egymástól a minta-szálban. Ha az e között a két terület közötti távolsággal kapcsolatban változások történnek, a változás világosan megfigyelhető ezzel a módszerrel. Ennél fogva a módszer alkalmas a megváltozott mRNS, a kromoszomális átrendeződések, az immunglobulin gének kifejeződéshez való átrendeződése, valamint öröklődési betegségek kimutatására is. így lehetséges megalkotni különböző reagens-kombinációkat a nukleinsav-fragmensek sorozataiból. így pl. a nemi betegségek okozó anyagainak azonosításához lehetséges olyan készleteket készíteni, amelyek magukban foglalnak egy vizsgáló mintát, amely gonorrheát, szifiliszt, herpeszt és chlamidiákat azonosító nukleinsav-fragmerisek sorozatát tartalmazza. Az azonosítás ebben az esetben gonorrheához, szifiliszhez, herpeszhez és chlamidiához külön-külön szűrőket alkalmazva lehetséges. A találmány főleg a pKTH 1220 és pKTH 1271 rekombináns plazmidokat tartalmazó nukleinsav-fragmensek sorozatára vonatkozik. A pKTH 1220 rekombináns plazmid, a pBR 322 plazmid vektorban, magában foglalja a Chlamydia trachomatis L 2 DNS-ét, amely a Chlamydiákra fajlagos. Ezt a rekombináns plazmidot klónozzuk az Escherichia coli K 12 HB101 gazdaszervezetbe. A 1271 rekombi-10 5 10 15 20 25 30 35 4C 45 50 55 6C 65
