194938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás javított nukleinsav-reagensek előállítására
Az azonosítandó nukleinsavakból vagy ezek részeiből restrikciós enzimek alkalmazásával különböző hosszúságú nukleinsav-fragmensek egész sora alakítható ki. Ha az azonosítandó genom restrikciós térképe ismert, lehetséges a genomból kiválasztani a megfelelő szomszédos fragmenseket, amelyek restrikciós enzimek alkalmazásával alakultak ki, és így a fragmenseket izolálhatjuk és rekombináns DNS technikával sokszorozhatjuk. Amikor ismeretlen genomról van szó, egy közbenső stádiumot kell alkalmazni a reagensek készítésében, olyan módon, hogy egy viszonylag nagy restrikciós fragmenst klónozunk, ezt a fragmenst feltérképezzük, és az a,, a2, a3, stb. és b1( b2, b3, stb. nukleinsav-fragmens sorozatok szériáit az így nyert információ alapján előállítjuk. Lehetséges természetesen a fenti módszerek kombinációit is alkalmazni és több nagy különböző klónozott restrikciós fragmenst alkalmazni kiindulási anyagként, és több különböző szériát készíteni, amelyet azután egyesítünk, hogy megfelelő kombinációt képezzünk. Előnyös az a,, a2, a3, stb. és b,, b2 és b3, stb. nukleinsav-fragmerrs szériákat a találmány szerint rekombináns DNS technikákkal olyan módon előállítani, hogy az a szériát egy vektorba, pl. pBR 322 plazmidba klónozzuk, miközben a b szériát egy másik megfelelő vektorba klónozzuk, amelynek nincsenek közös szekvenciái az előbbi vektorral. Az M13 bakteriofág lehet példa ilyen előnyös második vektorra. Az a szériához tartozó fragmenseket lehet egyesíteni egymással, és az egyesített szériákat egy vektorba lehet klónozni. Pl. az egymással egyesített a,-a2-t klónozni lehet, mint folyamatos beiktatást az azonos pBR 322 vektorba. Ennek megfelelő módon el lehet készíteni a b,-b2 reagens sorozatokat is. A klónozáshoz előnyös olyan vektorokat használni, amelyekhez idegen DNS nagyon nagy beiktatásai lehetnek csatolva. így pl. a lambda-fág és a kozmid vektorok megfelelők erre a célra. így a találmány szerint két, nukleinsav-fragmensek sorozatát tartalmazó reagens-pár szükséges a szendvics-hibridizálási módszerben: egy, az azonosítandó jel-vegyülettel jelzett reagens, azaz a vizsgáló minta, és egy úgynevezett szűrő-reagens, amely szilárd hordozóra van rögzítve. A legáltalánosabb radioaktív izotópokat alkalmaznak a vizsgáló minták jelzésére, így pl. a 2, 034, 323 lajstromszámú brit és 4, 358, 535 és 4, 302, 204 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások a következő izotópokat alkalmazzák: 32P, l25I, 13II, és 3H. A 79, 139 laistromszámú európai szabadalmi leírás a |25I izotópot alkalmazza. A nukleinsav vizsgáló mintákat különböző módokon módosították és jelölték pl. fluorescens jelzésekkel (2, 518, 755 lajstromszámú francia szabadalmi leírás). Alkalmaz-7 t ik enzimes vagy enzimesen mérhető jelzéseket is (2, 019, 408 lajstromszámú brit, 63, 879 lajstromszámú európai és 2,519,005 lajstromszámú francia szabadalmi leírások). A 70, 685 és 70, 687 lajstromszámú európai szabadalmi leírások fény-kibocsátó jelzést és jelölési módszert írnak le, és a 2, 518, 755 lajstromszámú francia szabadalmi leírás immunológiailag mérhető jelölést ír le. A 4, 374, 120 lajstromszámú amerikai egyesült államok beli szabadalmi leírásban leírt lantanid-kelátokat is lehet alkalmazni jelző vegyületként. A Leary és munkatársai által leírt (PNAS 80, 4045—4049 (1983)) biotin-avidin jelző anyag is alkalmas jelzésként. A találmány szerinti nukleinsav-reagensek jelzéséhez alkalmazható jelzéseknek néhány példáját említettük csak fentebb, de nyilvánvaló, hogy fejlesztenek majd ki új, javított jelző anyagokat, amelyek szintén alkalmasak lesznek a találmány szerinti nukleinsav-fragmens sorozatok jelzéséhez. A szűrő-reagensekhez alkalmas hordozók különböző nitrocellulóz-szűrők lehetnek (4, 358, 535 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli és 2, 095, 833 lajstromszámú brit szabadalmi leírás). A 148, 955 lajstromszámú NDK-beli szabadalmi leírás nukleinsavak kémiai kötési módszerét írja le hordozóra (papírra). A 4,359,535 és4,302,204 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások vegyileg módosított papírokat írnak le, amelyeket lehet szilárd hordozóként alkalmazni. Más változatok lehetnek a nylon membránok és módosított nitrocellulóz szűrők. Nyilvánvaló azonban, hogy új anyagokat is fejlesztenek ki majd, amelyek még alkalmasabbak lesznek a találmány szerinti szilárd hordozók céljára. Természetesen lehet használni még más szilárd hordozókat is, pl. különböző kromatográfiás mátrixokat, mint pl. triazinnal vagy epoxival akt vált cellulózt, látexet, stb. Elvileg nincs semmiféle más korlátozás a szilárd hordozó kiválasztásában, mint az, amelyet az alábbiakban leírunk. Lehetségessé kell tenni a nukleinsavak rögzítését egyszálú formában a szilárd hordozóhoz úgy, hogy ezek az egyszálú nukleinsavak hibridizálódni tudjanak a komplementer nukleinsavakkal. A szilárd hordozónak könnyen eltávolíthatónak kell lenni a hibridizáló oldattól, vagy a hibridizáló oldatnak kell könnyen eltávolíthatónak lenni a szilárd hordozótól. A vizsgáló mintának sem szabad a hordozó anyaghoz magához úgy tapadnia, hogy ne lehessen onnan lemosni. Az A és B vagy B és A nukleinsav-reagens sorozat párok fentebb leírt kombinációiból, amelyek jelezve,illetve szilárd hordozóra rögzítve vannak, és olyan nukleinsav-párokból, amelyek a különböző nukleinsavak azonosításához vannak készítve, lehetséges összeáll tani Ax és B*, Ay és Bÿ, kz és Bz kombinációt. Ezeket a kombinációkat lehet alkalmazni az x, y és z nukleinsavak egyidejű azonosí-8 5 194938 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
