194938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás javított nukleinsav-reagensek előállítására
ból. Sok egyformán hasznos módszer áll rendelkezésre a fragmensek ilyen sorozatának elkészítéséhez. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudnak készíteni nukieinsav-fragmens sorozatokat akár szintetikus, akár fél-szintetikus módszerekkel. A reagenseket olyan módon izoláljuk, hogy váltakozó nukleinsav-fragmensek legalább két szériáját, a,, a2, a3, stb-t és b,, b2, b3, stb-t, nyerjük. Az a,, a2, a3, stb szériákhoz tartozó nukleinsav-íragmenseket olyan íragmensekbői alkotjuk meg, amelyek közel, de nem szomszédosán helyezkednek el egymáshoz. A b^ b2, b3, stb szériákhoz tartozó nukleinsav-fragmenseket szintén olyan fragmensekből alkotjuk meg, amelyek közel, de nem szomszédosán helyezkednek el egymáshoz. Az a,, a2, a3, stb. szériához tartozó nukleinsav-fragmenseknek és a b,, b2, b3, stb, szériához tartozó nukleinsav-fragmenseknek nem szabad homológoknak lenni egymáshoz. Előnyös, ha az a,, a2, a3, stb. szériához tartozó nukleinsavakat olyan módon izoláljuk, hogy minden második fragmens tartozzék az a-szériához és minden második b-szériához, amint ez a 3. ábrában látható. A 3. ábrában a,, a2, a3 és b,, b2, b3 olyan nukieinsav-fragmens sorozatok, amelyek kielégítően homológok az azonosítandó nukleinsavra. Ez természetesen úgy is lehetséges, hogy még egy harmadik, c(, c2, c3, stb. nukieinsav-fragmens szériát is izolálunk ugyanabból a nukieinsavból, amint ez a 4. ábrán látható. Előnyös, ha a váltakozó két nukleinsav-reagens közvetlenül követi egymást, de ez nem abszolút előfeltétele a találmány szerinti eljárásnak. A fentebb leírt nukleinsav szériákat lehet használni vagy mint a,, a2, a3, stb. és b,, b2, b3, stb. elkülönített fragmenseket (5a. ábra) vagy egymással egyesített hosszabb szálakká ara2-a3, stb. és brb2-b3, stb. formában (5b. ábra). Természetesen el lehet készíteni az intermedier formák összes fajtáját, mint pl. egy olyan a-szériát, amelyben a, elkülönített fragmens és a2-a3 egyesítve vannak, és a b-szériában pl. b,-b2 vannak egyesítve egymással és a b3 van elkülönítve, stb., amint ez az 5c. ábrában látható. A 6. ábra szendvics-hibridek különböző sorozatait mutatja be. A 6a ábra olyan szendvics-hibridek sorozatait mutatja be, amelyekben a nukleinsav-fragmensek sorozatai el vannak különítve. A 6b ábra olyan hibridek sorozatát mutatja be, amelyben a nukieinsav-fragmensek jelzett sorozata egymással egyesítve van. A 6c ábra olyan esetet mutat be, amelyben szendvics-hibrideknek egy sorozata képződik nukleinsav-fragmensek mind egyesített, mind elkülönített jelzett sorozataiból. A 6. ábrában x jelenti az azonosítandó nukleinsavat, b,, b2 és b3 jelenti a jelzett vizsgáló mintát, és a,, a2 és a3 jelzik egy szilárd hordozóra rögzített nukleinsav-fragmensek sorozatát. Azokat a nukleinsav-íragmenseket, amelyek a b-szériához tartoznak, lehet pl. 5 4 olyan módon jelezni, hogy jelzett nukleinsav-reagenst alkalmazunk, azaz B vizsgáló mintát. Azokat a nukleinsav-reagenseket, amelyek az a-szériához tartoznak, olyan módon lehet szilárd hordozóra rögzíteni, hogy egy szilárd hordozóhoz kötött A nukleinsav reagenst nyerünk. Van természetesen más lehetőség is: egy jelzett A nukleinsav-reagens és egy megfelelő szilárd hordozóhoz kötött B nuk* leinsav-reagens előállítása. Ilyen A és B, vagy B és A nukleinsav-párokat, amelyek jelezve; illetve szilárd hordozóra kapcsolva vannak, számos különböző azonosítandó nukleinsavhoz lehet készíteni. Ezeket össze lehet kombinálni megfelelő nukleinsav-reagens kombinációkká, amelyek különböző A[ és B,, A2 és B2, A3 és B3, stb. vagy B, és A,, B2 és A2, B3 és A3, stb. nukleinsav-reagens párokból vannak összeállítva. Azokat a reagenseket, amelyek nukleinsav-fragmensek olyan sorozatait tartalmazzák, amelyek különböző nukleinsavakat azonosítanak, szintén lehet úgy kombinálni, hogy egy Av-A,,-A* vizsgáló mintát nyerjünk, amely pl. (ara2- -a3)x- (a1-a2-a3)(/-(a1-a2-a3)ï nukieinsav-fragmens sorozatot tartalmaz, amint ez a 7. ábrában látható, amelyben a,*, a2Jt, és a3.v az A* nukleinsav-fragmensek sorozatai, amelyek azonosítják az x nukleinsavat; az a, a2l/ és a3lJ az A y nukleinsav-fragmensek sorozatai, amelyek az y nukleinsavat azonosítják; au, a2,, és a3- az k, nukleinsav-fragmensek sorozatai, amelyek a z nukleinsavat azonosítják, és v egy vektor-eredetű nukleinsav-rész. Nukleinsav-fragmensek egyesített sorozatait természetesen szintén lehet alkalmazni, akár mint elkülönített fragmenseket, akár mint megfelelő keverékeket. A 8. ábra szerinti szendvics-hibridek sorozatát a 7. ábrában bemutatott reagensek alkalmazásával nyerjük. Ha több különböző nukleinsav egyidejű meghatározása szükséges, akkor természetesen elkülönített szűrőket kell alkalmazni, amint ez a 8. ábrában látható. A 8a. ábra az x nukleinsavat azonosító szilárd hordozót mutat be, a 8b. ábra az y nukleinsavat azonosító szilárd hordozót, a 8c. ábra pedig a z nukleinsavat azonosító szilárd hordozót. A 8a, 8b és 8c ábrákban a b,t és b2ï egy szilárd hordozóra rögzített és az x nukleinsavat azonosító nukleinsav-fragmensek sorozatát jelöli; a blÿ és b2ÿ egy szilárd hordozóra rögzített és az y nukleinsavat azonosító nukleinsav-fragmensek sorozatát jelölik; és a b,- és b2, egy szilárd hordozóra rögzített és a z nukleinsavat azonosító nukleinsav-fragmensek sorozatát jelölik;és x, y és z a meghatározandó nukleinsavak.Ff, Fÿ és F, a megfelelő szilárd hordozók vagy szűrők. kx-ky-k, egy vizsgáló minta, amely mind a három nukleinsavat egyidejűleg azonosítja, ha elkülönített szilárd hordozókat alkalmazunk. A fentebb leírt nukieinsav-fragmens szériák, reagensek és reagens-kombinációk ismert rekombináns DNS technikákkal készíthetők. 6 194938 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
