194938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás javított nukleinsav-reagensek előállítására
194938 A találmány tárgyai javított nukleinsav-reagensek, amelyek nukleinsav-fragmensek sorozatát tartalmazzák, valamint az ilyen javított reagensek kombinációi. A találmány tárgyai még a kiónok sorozatát tartalmazó nukleinsav-reagenseknek és az ilyen nukleinsav-reagensek kombinációinak előállítási módszerei rekombináns DNS technikákkal, valamint ezek alkalmazása a nukleinsavak azonosítására hibridizálási módszerekkel. Különböző hibridizálási módszereket alkalmaznak általában a nukleinsavak azonosítására és tanulmányozására. Ilyenre példák a direkt hibridizálási módszerek, amelyben az azonosítandó nukleinsavat tartalmazó minta vagy oldatban van (Bräutigam és munkatársai: J. Clin. Microbiol. 12, 226—234 (1980), és 2, 019, 408 lájstromszámú brit szabadalmi leírás), vagy szilárd hordozóra van rögzítve (4, 139, 346; 4, 302, 204; 4, 358, 535; 4, 395, 486 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások, 2. 034, 323; 2, 095, 833 lájstromszámú brit szabadalmi leírások, 62, 286; 62, 237; 61, 740 lajstromszámú európai szabadalmi leírások), és egy jelzett nukleinsav reagens alkalmazásával van kimutatva, amely reagens hibrídizálódik az azonosítandó nukleinsavval. Más ismert hibridizálási módszerek közt találjuk a kétlépcsős szendvics-hibridizálási módszert, amelyet Dunn és Hassell mutatott be (Cell, 12, 23—36 (1977)),és az egylépcsős szendvics-hibridizálási módszert, amelyet a 79, 139 lajstromszámú európai szabadalmi leírás ismertet. A nukleinsavak azonosításához szendvics-módszerekkel két külön nukle insav-reagens szükséges, hogy kimutassák a minta-oldatban jelen levő nukleinsavakat. A két reagens egyikét szilárd hordozóra rögzítik, és a másikat jelzéssel látják el. A nukleinsav-reagensekre, mind arra, amely a szilárd hordozóra van rögzítve, mind arra, amely jelezve van, az jellemző, hogy bázis szekvenciájuk komplementer, vagy közel komplementer az azonosítandó nukleinsavakra, vagyis homológ. Az alkalmazott nukleinsav-reagensek vagy természetes nukleinsavak, mint olyanok, vagy ezek fragmensei. A íragmenseket pl. restrikciós enzimeket alkalmazva lehet előállítani. Nukleinsav-reagenseket lehet előállítani szintetikusan is, vagy rekombináns DNS-technikával. Természetes plazmidokat (4, 358, 535 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), bakterofágokból származó nukleinsavakat (4, 543, 535 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), riboszomális RNS-t és messenger (hírvivő) RNS-t (4, 302, 204 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), vagy különböző vírusokból származó nukleinsavakat (Stalhandske és munkatársai: Curr. Top. Microbiol. Virol 104, (1983)) alkalmaztak nukleinsav-reagensként. A teljes vírus-genomot alkalmazták pl. egy hibrid vírus messen-1 ger RNS-ében levő különböző vírusokhoz tartozó részek azonosításához (Dunn és Hassell, Cell, 12, 23—26 ( 1977) ). Nukleinsav-reagenseket állítottak elő rekombináns DNS-technikákat alkalmazva is (4, 395, 486 és 4, 359, 535 lajstromszámú amerikai egyesült állafnokbeli szabadalmi leírások, a 79, 139 és 62, 286 lajstromszámú európai szabadalmi leírások és a 2, 034, 323 lajstromszámú brit szabadalmi leírás). A rekombináns DNS technikákkal előállított nukleinsav-reagenseket vagy olyan módon alkalmazzák, hogy a replikáit, meghatározott DNS fragmenst megtisztítják a vektor DNS-étől, vagy rekombináns DNS molekulák formájában, amelyek különböző vektorokhoz vannak kötve. A korábban használt, rekombináns DNS technikákkal előállított nukleinsav reagensek vagy egy folytonos azonosító nukleinsav-fragmensből, vagy számos elkülönített klónból állnak. Mi új, érzékenyebb nukleinsav-reagenseket fejlesztettünk ki, amelyek nukleinsav-fragmensek váltakozó sorozatának legalább két szériájából állnak, amely sorozatok vagy egy, vagy több, az azonosítandó nukleinsavra homológ szegmensekből készültek. Azok a nukleinsav-reagensek, amelyek a nukleinsav-fragmenseknek ilyen sorozatát tartalmazzák, szendvics-hibridizálási vizsgálatokban legalább kétszer olyan érzékenyek, mint a korábban alkalmazott nukleinsav-reagensek. A találmány szerinti nukleinsav reagenseket vagy azok kombinációit alkalmazva kisebb mennyiségű nukleinsavat is azonosítani lehet, mint korábban, és ezek különösen jól alkalmazhatók szendvics-hibridizálási módszerekhez. A találmány szerinti nukleinsav-reagensek nagyobb érzékenysége a szendvics-hibridizálási módszerekben részben azon a tényen alapszik, hogy különböző vizsgáló minták alkalmazása növeli a jelzett hibridek mennyiségét a szilárd hordozón. Itt lehetnek jelzett, vektorokból származó nukleinsavak minden hibridizálási minta mentén (1. és 2. ábra). Az 1. és 2. ábrában v jelzi a vektorból származó DNS-t, x az azonosítandó nukleinsavat, b a jelzett vizsgáló mintát, a a szilárd hordozóra rögzített azonosító nukleinsavat, és F a szűrőt. Amikor különböző vizsgáló mintákat alkalmazunk, a jelzett, vektorból származó nukleinsav részek mennyisége nő, és több jelzés kötődik a képződő hibridekre. A hibridek így könnyebben mutathatók ki. Amikor a találmány szerinti nukleinsav-fragmens sorozatot alkalmazzuk a szendvics-hibridizálási módszerben, legalább két, vagy, amint ez az 1. ábrában látható, három azonosító nukleinsav-fragmenst rögzítünk a szilárd hordozóhoz, pl. a,, a2, és a3, egy vagy több ponton a reakció mértékétől függően. Amikor a reakcióeléri végső stádiumát, egy 1. ábra szerinti helyzet állhat elő, amelyben a minta-szál hurkot vagy hurkokat képez, amelyekhez a vizsgáló minta vagy minták,pl. az 1. ábrában b, és 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
