194808. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új alfa-allén-alfa-aminosavak és ilyen hatóanyagokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

194808-tartalmú frakciókat összegyűjtjük, és betöményítjük. A kapott maradékot nagynyomású folyadék-kromatográfiás módszerei (5%-os metanol/víz, pH 4,5-ös acetát/citrát (2:1) puffer) tovább tisztítjuk, és végül hidroklorid-sóvá alakítjuk. Ügy is eljárhatunk, hogy a szabad aminosavat aceton/víz elegyből végzett kristályosítással állítjuk elő, savas hidrolízis, gradiens ioncserés kromatografálás és sótalanítás után. A cím szerinti vegyület fizikai jellemzői a következők:

Olvadáspont: 205—235°C (bomlik) IR-spektrum (KBr): 1977 cm"“1 (C=C=C); 'H-NMR spektrum (delta D20): 3,5 (AB, 2H, CH2-), 5,25 (d, 2H, CH=C), 5,7 (d, 1H,

HC=C), 7,45 (s, 1H,

im-CH), 8,75 ppm (d, 1H, im-CH) ;

13NMR-spektrum (delta D20): 209,00 ppm (C=£.=C), MH+ 194.

21. példa

2-Amino-3-metil-3,4-pentadiénsav

75,6 mmól LDA (diizopropil-amin és 1,55 mól n-butil-lítium —78°C-on végzett reagáltatásával készítjük) 100 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült oldatához 36 mmól N-Boc-glicin-butinal-észter 20 ml tetrahidrofuránnal készült oldatát csepegtetjük. Az utóbbi észtert N-BQC-glicinből és 2-butil-1 - -ol-ból R. Olsen és munkatársai, JOC, 47, 1962, 1982, módszerével készítjük. Egy óra múlva 9,6 ml klór-trimetil-szilánt adunk az elegyhez, és a reakcióelegyet lassan szobahőmérsékletre melegítjük, majd visszafoiyatás mellett egy órán át forraljuk. Az elegyet szobahőmérsékletre hűtjük, majd 20 ml metanolt adunk hozzá, és további egy óra múlva betöményítjük. A kapott maradékot felvesszük etil-acetátban és többször 5%-os vizes nátrium -hidrogén-karbonát oldattal extraháljuk. A vizes fázist diklór-metánt tartalmazó, kétfázisú rendszerben 20%-os vizes sósav-oldattal,

3,0 pH-értékig savanyítjuk. A diklór-metános fázist elkülönítjük, és a vizes fázist ismét diklór-metánnal extraháljuk. Az egyesített diklór-metános extraktumokat egyszer vízzel, majd viz.es konyhasó-oldattal mossuk, és vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk. Betöményítéssel 1,3 g maradékot kapunk, amely 1960 cm“"1 hullámhossznál allén-sá- Vot mutat. Ezt felvesszük 50 ml sósavval telített etil-acetát oldatban, szobahőmérsékleten, ami sárga csapadék kiválásához vezet. Egy óra múlva a reakcióelegyet betöményítjük, és a kapott maradékot vízben oldjuk, és diklór-metánnal mossuk. Ezután a vizes fázist ioncserélő oszlopra öntjük (H), az eluálást 20%-os piridin/víz eleggyel végezve. Az eluátumot betöményítjük, fordított fázisú kromatografálással részben tisztítjuk, majd aceton és víz elegyéből kristályosítjuk.

A cím szerinti vegyületet kapjuk, amely 195—200°C-on bomlás közben olvad, hozam: 20%.

19

IR-spektrum (KBr): 1960 cm-1 (C=C=C); 'H-NMR spektrum (delta, D20): 1,82 (t, 3H, J=3,2 Hz, CH3), 4,2 (t, 1H, J—1,7 Hz, CHN),

5,0 ppm (m, 2H, H2C=C).

Analóg módon állíthatunk elő 2-amino-3,4-pentadiénsavat N-BOC-glicin-3-trimetil-szilil-2-propinil-észterből. Az észter [3,3] átrendezése után a trimetil-szilil-csoportot 0,1 n metanolos nátrium-hidroxid oldattal szobahőmérsékleten végzett 2 órás kezeléssel távolijuk el, majd HCl/EtOAc kezeléssel lehasítjuk a BOC csoportot, a terméket ioncserélő kromatográfiával, majd nagynyomású, fordított fázisú folyadék-kromatográfiával kezeljük, és így a kívánt vegyülethez jutunk. 'H-NMR spektrum (delta Ó20): 4,25 (m, 1H, CHN), 5,15 (m, 2H, H2C=C), 5,5 ppm (app t, J=6,7 Hz, HC=C).

22. példa

In vitro vizsgálatok

A találmány szerint előállított vegyületek inaktiválják az alfa-aminosav-dekarboxiláz enzimeket. A következő példákban olyan kísérleteket mutatunk be, amelyekkel a vegyületek inaktiváló hatását jellemezhetjük.

Vizsgálati módszerek

Sertésveséből emlős DOPA dekarboxilázt izoláltunk, és tisztítottunk, Borri-Voltaforni és munkatársai [Eur. J. Biochem., 93, 181 (1979)] módszerével, amelyet Rudd és Thannassi [Biochemistry, 20, 7469 (1981)] szerint módosítottunk. A Sigma Vhemical Co.-tól nyers extraktum formájában bakteriális L-fenil-alanint és L-tirozin-dekarboxilázt (ex Streptococcus Faecalis) vásároltunk, és a vizsgálatokhoz az anyagot további tisztítás nélkül használtuk fel.

Az emlős DOPA időfüggő inaktiválását úgy vizsgáltuk, hogy az enzimet a 2-amino-2- (3,4-dihidroxi-benzil) - penta-3,4-diénsav 4 —100 mól-ekvivalens feleslegével 6,8 pH-értéken, 37°C-on inkubáltuk. Alkalmas időközönként az elegy alikvot részeit elkülönítettük, 30-szorosra hígítottuk, hogy az L-DOPA feleslegbe kerüljön (2 mM), és meghatároztuk a maradék DOPA dekarboxiláz aktivitást.

A DOPA dekarboxiláz aktivitást rutin méréssel, folyadék-kromatográfiás módszerrel és a katecholamin termékek elektrokémiai detektálásával határoztuk meg. A DOPA dekarboxilázt (1—5 mikrogram, 1—20 egység) L-DOPA-val (2000 mikromól, 150 mikroliter) és PLP-vel (10 mikromól) inkubáltuk 0,1 mólos, 6,8 pH-értékű foszfát-pufferben, 37°C-on.

1 —10 perc múlva a reakciót 2 mól (25 mikroliter) citromsav hozzáadásával befagyasztottuk, desztillált vízzel kétszeres térfogatra hígítottuk az elegyet, és 10 mikroliteres alikvot mintákat nagynyomású folyadék-kromatográfiás módszerrel, fordított fázisú Brown-20

11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65