194721. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces eredetű metabolitot tartalmazó takarmányadalék előállítására
5 194 721 6 Mycobacterium phlei ATCC 10142 23,0 Mycobacterium smegmatis ATCC 607 30,0 Streptomyces griseus SCS 3496 26,0 A találmány eljárás az E/240jelű metabolit előállítására, mely összetevők: C=33,08%, N= 13,88%, H= 6,68%, O=38,41%, S = 1,80%, (hamu) 15%, Op. : 198°C, vizes oldatban felvett ultraibolya spektrumában = nmnél jellemző maximum van, infravörös spektrumában értékelhető abszorpciós sávok vannak a 2200-3600 cm'1 (C-H, OH, NH, N-H) 1645 cm'1, (amid I sáv, C=0, amid II sáv C-N), 1390 cm'1 (CH3) 1310 cnT1 (C-N), 1240 cm-' (C-C, C-O) tartományokban, antibiotikus aktivitása: 500 Str. U/mg az 1. táblázat szerinti spektrummal, úgy hogy a metabolit előállítását a 00285 OKI MNG számon deponált Streptomyces lavendulae törzzsel 0,5-15,0% polihidroxi-vegyületet, mint szénforrást, továbbá szerves nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, aerob szubmerz tenyésztéssel inokulumot készítünk, a kapott inokulumot egyedüli szénforrásként 2-10% természetes polihidroxi-vegyületet, továbbá szerves nitrogénforrást, nitráttól eltérő szervetlen nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajra oltjuk, és aerob szubmerz körülmények között tenyésztjük 48-150 órán át, majd az E/240 metabolittartalmú fermentlevet eredeti állapotában, adott esetben sűrítve, dehidrálva hozamfokozó és/vagy terápiás hatású takarmányadalékként felhasználjuk, vagy az E/240 hatóanyagot izoláljuk és takarmányadalékként v. direkt terápiás célra felhasználjuk. Továbbá az eljárást jellemzi, hogy szénforrásként polihidroxi-vegyületet, előnyösen keményítőt alkalmazunk, valamint szerves nitrogénforrásként növényi fehérjét, szervetlen nitrogénforrásként nitráttól eltérő vegyületet, előnyösen ammónium-kloridot használunk. Az eljárásra jellemző, hogy a táptalajok kémhatását pH: 4,0-8,0, előnyösen pH: 7,2 értéken tartjuk, valamint a fermentációt 15-40°C-on, előnyösen 34°C-on végezzük. A fermentációt 0,2-1,5 liter levegő/liter táptalaj/perc, előnyösen 0,5 liter levegő/liter táptalaj/perc levegőztetés mellett végezzük, továbbá a fermentációt 48-150 óráig, előnyösen 96 óráig végezzük. További jellemzői az eljárásnak, hogy az E/240 hatóanyag-tartalmú fermentlevet vagy annak sűrítményét használjuk takarmányadalékként 0,2-10%, előnyösen 1,5% mennyiségben, vagy hogy az E/240 hatóanyag-tartalmú fermentlevet dehidráljuk, és ezt használjuk takarmányadalékként 0,1-2,0%, előnyösen 1,0% mennyiségben. A találmány szerinti eljárás foganatosítási módja még, hogy az E/240 hatóanyagot fermentléből v. koncentrátumból izoláljuk és takarmányadalékként v. terápiás célra felhasználjuk. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa: A Streptomyces lavendulae E/240 tenyészetek átoltását 1-4 havonta végeztük úgy, hogy kémcsövekben, ferdített burgonya- vagy zablisztfőzetes agarra vonáskultúrákat készítettünk aszeptikus körülmények között. Az átoltott kultúrákat 28 °C-on 6 napig inkubáltuk. A kifejlett telepeket tartalmazó kémcsöveket + 4°C hőmérsékleten maximum 1 hónapig, steril paraffinolaj alatt - hasonló hőmérsékleten - maximum 4 hónapig károsodásmentesen tároltuk. A Blake-tenyészetek táptalaja burgonya- vagy zablisztfőzetes agar. A Blake-kultúrát a kémcsőről készített csíraszuszpenzió 5 ml-ével oltottuk be. (5xl06 csíra/ml). Az inkubálást 25-28 °C-on 14 napig végeztük. 5 A kifejlett tenyészeteket +4 °C-on 3 hónapig tároltuk. Az oltóanyagot Blake-tenyészetekről állítottuk elő úgy, hogy a Blake-kultúrákat l%o -es Tween -80 steril csapvízzel lemostuk. Egy Blake-tenyészet lemosásához 150 ml mosóoldatot használtunk. A kapott sejt- 10 szuszpenzió 2x10'° élő csírát tartalmazott ml-enként. A fermentációs táptalajt egy 1000 1-es rozsamentes fermentorban készítettük el. A tápoldat mennyisége 700 1 volt. Összetétele: Dextrózl,00% 15 Keményítő 0,50% Szójaliszt 1,00% Nátrium-klorid 0,20% Kalcium-karbonát 0,10% Olaj (pálma) 0,20% 20 A sterilezést 120 °C-on 30 percig végeztük. A fermentor beoltásához 2 db Blake-tenyészetről lemosott, 300 ml térfogatú csíraszuszpenziót használtunk fel. A fermentálást 100 órán keresztül végeztük 28 °C-on. A tápoldaton 350 liter levegőt hívattunk át per- 25 cenként. A fermentálás során vizsgáltuk a fermentlé hidrogénion-koncentrációját, a sejtszaporodást, a hatóanyag képződését. (Az eredmény az 5. és 6. ábrán látható.) Kivett mintákban vizsgáltuk a tenyészlé szénhidrát- 30 koncentráció vátozását, az elmenő levegő széndioxid-tartalmát, a habzásintenzitást és a habzási periódusokat. A fermentáció befejezésekor a lé szárazanyag-tartalma 1,2%, hatóanyag-tartalma 1100 mg/liter volt. A fermentlevet bepárlás nélkül közvetlenül porlasztva szárí- 35 tóra juttattuk. A kapott poralakú félkész termék menynyisége 7,9 kg, hatóanyagtartalma pedig 0,9% volt. Az így kapott félkész termék homokszínű, enyhén higroszkópos por. Megvizsgáltuk a Str. lavendulae E/240 fermentált 40 biomassza legfontosabb nélkülözhetetlen aminosavtartalmát %-ban összehasonlítva a „Flavomycin” biomasszák aminosav tartalmával. Megállapítható, hogy a találmány szerint előállított takarmányadalék előnyösebb mennyiségben tartalmazza a legfontosabb nélkü- 45 lözhetetlen aminosavakat is. 2. példa: A zablisztes, ferdített agaron fenntartott kémcsőtenyészetről Tween-80 l%o -es csapvizes steril oldatával mostuk le a spórákat. Az így kapott spóraszuszpenzió 50 5-5 ml-ével Erlenmayer-lombikokban elkészített, steril 100-100 ml tápoldatot oltottunk be. Az Erlenmayer-lombik-tenyészet táptalaj-összetétele: Dextróz 2,50% 55 Keményítő 1,50% Szójaliszt 2,00% Nátrium-klorid 0,30% Kalcium-karbonát 0,15% Olaj (pálma) 0,20% 60 pH 6,5 A táptalajt autoklávban 30 percen keresztül 120 °C-on sterileztük. ■ Inkubálás: 28 °C-on, 48 órán át. A jól fejlett, 48 órás tenyészetekkel 200 literes elő- 65 inokulumot oltottunk. 4
