194721. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces eredetű metabolitot tartalmazó takarmányadalék előállítására
7 194 721 8 Az előinokulum táptalaj-összetétele: Dextróz 1,00% Keményítő 3,00% Szójaliszt 2,00% Nátrium-klorid 0,30% Kalcium-karbonát 0,15% Olaj (pálma) 0,30% pH: 6,5 Sterilezése: a készülékkel együtt, 120 °C-on, 60 per-cig. Inkubálás: 28 °C-on, 48 órán át. Levegőztetés: 100 liter/perc. A jól fejlett, steril, 48 órás, 200 literes előinokulummal 1,800 liter oltás előtti térfogatú, főinokulumot oltottunk. A főinokulum táptalaj-összetétele, sterilezése, inkubálása megegyezik az előinokuluméval. A 48 órás főinokulum-tenyészettel egy 50000 literes, rozsdamentes fermenterben sterilezett 33 000 liter oltás előtti térfogatú fermentációs táptalajt oltottunk. A főinokulum mennyisége 2000 liter volt. A fermentációs végtérfogat 35 000 literre egészült ki. A fermentációs táptalaj-összetételt 35 000 liter végtérfogatra számítottuk. A táptalaj összetétele: Dextróz 0,50% Keményítő 4,00% Szójaliszt 4,00% Nátrium-klorid 0,30% Nátrium-karbonát 0,20% pH: 6,5 A fermentálás folyamán a habzás gátlására további 1,7% pálmaolajra volt szükség. A tápoldat sterilezését 120 °C-on 60 percig végeztük. Hőmérséklet: szaporodási fázisban: 28 °C, termelési fázisban 34 °C. Levegőztetés: 9000 liter/perc. A tiszta fermentációs idő 100 óra volt. A kész fermentlé szárazanyag-tartalma: 2,7-3,0%, a fermentlé hatóanyag-tartalma: 5 400 g/m3. (A tartalom alakulása a 7. ábrán.) A kész fermentlevet 30-60 °C-on vákuumbepárlóval 20-30% szárazanyag-tartalomig koncentráltuk. A koncentrátumot porlasztva szárítóval szárítottuk meg. A 35 m3-es fermentációból nyert porított félkész termék súlya 1 tonna volt, amely 15% hatóanyagot tartalmazott. A félkész termék homokszínű, higroszkópos por. A porlasztóit, higroszkópos félkész terméket Sirály típusú keverőműves dobszitán átszitáltuk. Az áteső hányad szalagkeverős homogenizátorba jutott. A visszamaradó hányadot Perplex-darálóval megdaráltuk, és újból a Sirály-szitára juttattuk. A homogenizátort 20 percen keresztül üzemeltettük, majd a homogenizált félkész terméket polietilénnel bélelt nátronzsákokba gyűjtöttük. A homogenizált félkész termék hatóanyagtartalmát búzakorpával 4,0%-ra állítottuk be. 3. példa A metabolit E/240 hatóanyag izolálását előnyösen úgy végezhetjük el, hogy az 1. vagy 2. példák szerint aktív anyagot tartalmazó fermentlevet állítottunk elő. A pH-t foszforsawal 2,0-ra állítjuk be, majd a micéliumot szűréssel eltávolítjuk. Szűrés után NaOH-dal a pH-t visszaállítjuk 7,0-ra. A közömbösítéskor keletkező finom csapadékot szintén szűréssel távolítjuk el. Az élesre szűrt fermentlevet egy Na-ciklusban levő karboxil típusú ioncserélő gyantával töltött oszlopon folyatjuk át. (Átfolyási sebesség: a gyanta térfogatának lesz 10-szerese óránként.) Az ioncserélő gyantáról a megkötött aktív anyagot N HCL-al eluáltuk. Az eluátumot NaOH-dal közömbösítjük, majd szűrjük. A megkötés folyamata agargél-diífúziós módszerekkel követhető nyomon. A fenti eljárással az aktív anyag 95%-a kinyerhető az oszlopra a fermentléből. A neutrális pH-jú eluátumot vákuumban 60 °C-ra bepároljuk. A bepárlási maradékból az aktív anyagot metanollal oldjuk viszsza, pH-ját NCL-al pH 2,0-ra állítjuk be, majd négyszeres térfogatú absz. acetonba csöpögtetve az aktív anyag hidrokloridja kicsapható. Az oldószerelegyet dekantálással eltávolítjuk, és a csapadékot 50 °C-on vákuumban megszárítjuk. A metanolos oldást és acetonos kicsapást ismételve 2-3-szor a szervetlen kísérő szennyezők túlnyomó része eltávolítható. A tisztított aktív anyag enyhén sárgás színű, igen higroszkópos por. Az eljárás 70-90%-os kitermelést biztosít. Eljárhatunk úgy is, hogy az aktív anyagot valamely szerves oldószerrel, előnyösen 80%-os vizes metanollal a szárított biomasszából extraháljuk, acetonban kicsapjuk, majd a csapadékot vákuumban megszárítjuk. A fenti eljárásokkal előállított metabolit aktivitása sterptomycin egységben .kifejezve: 500 E/mg. Az anyag jól oldódik a vízben, metanolban gyengén, etanolban alig. Nem oldódik acetonban, éterben és más organikus oldószerekben. pH: 2,0-8,0 között a forrás hőmérsékletét 20 percig aktivitáscsökkenés nélkül elviseli. Op: 198 °C (bomlás mellett). Mikroégetést végezve, a C, N, H, O, S, és hamuanalízis adatai a következők: C = 33,08%, H = 6,68%, O = 38,41%, S = 1,80%, hamu =6,15%. Az anyag aktív csoportjainak és karakterénekjellemzésére elvégeztük a szokásos vizsgálatokat. Megállapítható volt, hogy az aktív anyag az itt figyelembe vehető fontosabb antibiotikumokkal egyező reakciókat nem ad. A csoportreakciók, valamint az ultraibolya és az infravörös abszorpciós spektrum alapján a fenti eljárással előállított antibiotikus hatású metabolit egy peptid karakterű vegyület. (Lásd a 8. és 9. ábrán.) A tisztított, kristályos anyagból 10%-os oldatot készítettünk. Száz, egyenként 28-30 grammos fehéregérnek intraperitonialisan, lege artis 0,5 ml-t (5cg hatóanyagot) fecskendeztünk be. Az injekciózás után az állatok kb. 1/2 órán át bágyadtak voltak, majd fokozatosan felélénkültek. Ivóvíz- és takarmányfogyasztásuk, székletük, vizeletürítésük normális volt. A külső ingerekre élénken reagáltak. Egyetlen elhullás volt oltási baleset következtében (bélperforáció). Az applikációt követően 48 óra múlva tíz egeret felboncoltunk. A szúrás helyén, a hasfal belső felületén subserosus parenchimákat és a hasüregben megnövekedett, halványrózsaszín, nem bűzös, nem nyúlós folyadékot találtunk. Egyéb kimutatható patalógiás tünet nem volt. Ezt követően, hasonló körülmények között, a dózist 0,75 ml-re (7,5 cg) emeltük. A vizsgálati eredmény itt is azonos volt a fent leírtakkal. A kb. 2 g/testsúlykilogramm-os dózissal az LD-50-et nem sikerült megállapítani. Az anyag gyakorlatilag nem toxikus. A fermentációs folyamat 1. és 2. példái szerint előállított fermentlevet a fentebb ismertetett eljárás szerint bepároljuk, szárítjuk, majd homogenizáljuk. Az így előállított anyag az antibiotikus aktivitás kémiai és biológiai ellenőrzése után alkalmas takarmánykiegészítő 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
