194584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorgátló hatású, fehérjeszerű anyag és az erre fajlagos, hordozóhoz kötött monoklonális antitestek előállítására
mellett tenyésztjük az 1A. példa szerinti táptalajban, a titer a 3. napon 140 egység/ml-re, a 6. napon 630 egység/ml-re növekedik. 10,7 X 107 sejt/cm2 denzitás esetén a titer a 2. napon 630 egység/ml, és a 4. napon 1580 egység/ml-re növekszik. 1 2. példa ATFelőállítása szérummentes tápközegben A J774.1 sejteket magzati borjúszérumot tartalmazó RPMI—1640 táptalajban addig tenyésztjük, míg összefüggő tenyészetet kapunk, majd a tápközeget szérummentes tápközegre cseréljük, és a J774.1 sejteket néhány napon át abban tovább tenyésztjük. A fenti módon kapott felülúszó folyadékban az ATF titere 2000 egység/ml. 3. példa A TF előállítása forgó tenyészetben A J774.1 sejteket 37 °C-on szérummén tes tápközegben, forgó tenyésztő lombikban 3—7 napon át tenyésztjük. Ily módon olyan felülúszó folyadékot kapunk, amelynek ATF-titcrc 1412 egység/ml. 4. példa A TF előállítása mikrohordozó alkalmazásával A J774.1 sejteket és a mikrohordozót — például DEAE-dextrán gyöngyöt (Dainíhon Seíyaku) vagy Cytodex-et (Pharmacia Fine Chemicals) 20 % magzati borjúszérummal kiegészített RPMI-1640 táptalajt tartalmazó forgó lombikba helyezzük, majd a sejteket 3 napon át 37 °C-on tenyésztjük, eközben a sejtek a mikrohordozóhoz tapadnak. Ezután a táptalajt szérummentes tápközegre cseréljük, és a tenyésztést 37 °C-on tovább folytatjuk. A fenti módon olyan felülúszót nyerünk, amelyben az ATF titere 700 egység/ml. 5. példa Szérummentes táptalajban előállított ATF tisztítása A 2. példa szerint nyert felülúszó 3 literéhez 70 ml 1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,2 mól/1 koncentrációjú foszfát-puffért (pH 7,5) adunk. Az elegyet jeges hűtés közben keverjük, és porított ammónium-szulfáttal 65 %-ra telítjük. 4 óra múlva az elegyet 12 fordulat/perc sebességgel 30 percen át centrifugáljuk, majd a csapadékot 1,5 ml 1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,2 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferben (pH 7,5) oldjuk. A fenti lépésnél az aktivitás 95 %-át nyerjük vissza, és a tisztítás foka 2,2-szeres, a kiindulási felülúszóhoz viszonyítva. Az ammónium-szulfátos frakciót ezután Sephacryl S-200 oszlopra (2,5 X 85 cm) visszük, amelyet előzőleg 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) ekvilibrálunk. Az eluálást ugyanezzel a pufferrel végezzük, 20 ml/óra átfolyási sebességgel. 9,2 ml-es frakciókat szedünk folyamatosan. Az ATF-et tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és ultraszűréssel koncentráljuk. Ennél a lépésnél az aktivitás 99 %-át visszanyerjük, és a tisztítás foka 3,2-szeres. A két lépésben együttesen 94 %-át nyerjük vissza az aktivitásnak, és a tisztítás foka az eredeti felülúszóhoz képest 7,2-szeres. A gélszűréssel kapott aktív frakciókat ezután Blue- Sepharose CL-6B-vel töltött oszlopon (2,0X11 cm, Pharmacia Fine Chem.) folyatjuk át, melyet előzőleg 0,05 mól/i nátrium-kloridot tartalmazó 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7.5) ekvilibrálunk. 6 ml-es frakciókat szedünk, az átfolyási sebesség 4 ml/óra. A fenti pufferoldáttal végzett alapos mosás után az abszorbeálódott anyagot 1,0 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferiel (pH 7,5) eluáljuk. Az abszorbeált frakcióknak nincs ATF-aktivitásuk, az összes aktivitást a nem-abszorbeált frakciókat ultraszűréssel koncentráljuk. A fenti lépés után az aktivitás 84 %-át nyerjük vissza, a tisztítási fok 12-szeres. Az eredeti felülúszóhoz képest a visszanyerés 78 %, a tisztítási fok 85-szörös. Az aktív frakciókat ezután DEAE-Sephádex A—50 töltetű oszlopra (2,0X8,0 cm, Pharmacia FineChem.) visszük, melyet előzőleg 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) ekvilibrálunk. A fenti pufferrel mossuk az oszlopot, majd az eluálást 0,3 mól/1 nátrium-kloridot, illetve 0,5 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel végezzük. Az aktív frakciókat a 0,3 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó foszfát-pufferrel eluáljuk, majd ultraszűréssel koncentráljuk. Ennél a lépésnél az aktivitás 80 %-át nyerjük vissza, és a tisztítás foka 5-szörös. A kiindulási anyaghoz képest a visszanyerés 63 %, a tisztítási fok 427-szeres. Az aktív frakciókat TSK—G3000-SWG töltetű nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopra (2,1 cmX X 60 cm, TOYOSODA Co., Ltd.) visszük, melyet előzőleg 0,3 mól/1 nátrium-szulfátot tartalmazó 0,01 mól/I koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 6,8) ekvilibrálunk. 2,0 ml/perc átfolyási sebesség mellett 2 ml-es frakciókat szedünk. Ennél a lépésnél az aktivitás 37 %-át nyerjük vissza, és a tisztítás foka 2,4-szeres. A kiindulási anyaghoz képest a visszanyerés 23 %, a tisztítás foka 1025-szörös. A TSK-G3000-SWG-vel kapott aktív frakciókat TSK-DEAE-3SW töltetű nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopra (7,5 mmX75 mm, TOYOSODA Co , Ltd.) visszük, melyet előzőleg 0,04 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 6,8) ekvilibrálunk. Az oszlopo* ugyanezzel a pufferrel, majd 0,15 mól/1 nátrium-kloriddal kiegészített fenti pufferrel mossuk. Az ATF-et 0,15—0,5 mól/1 lineáris nátrium-klorid-gradienssel eluáljuk. 0,6 ml/perc átfolyási sebesség mellett 1,2 ml-es frakciókat szedünk. A fenti módon nyert tisztított ATF poliakrilamid gélelektroforézis lemezen egyetlen sávot ad. A fenti lépésnél az aktivitás 30 %-át nyerjük vissza, a tisztítási fok 2,5-szeres. A teljes visszanyerés 7 %, a tisztítási fok 2563-szoros;, Az ATF specifikus aktivitása 1,1 X 105 6 egység/mg-protein. 584 2 194 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
