194584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorgátló hatású, fehérjeszerű anyag és az erre fajlagos, hordozóhoz kötött monoklonális antitestek előállítására
6. példa 1 194 584 2 Szérumtartalmú tápközegben előállítottATFtisztítása Az 1. példa szerint előállított felülűszó 3 literéhez 250 ml, 1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,2 mól/1 koncentrációjú foszfát-puffért (pH 7,5) adunk. Az elegyet keverés és jeges hűtés közben porított ammónium-szulfát fokozatos hozzáadásával 30 %:ra telítjük. 3 óra múlva az elegyet 12 000 fordulat/perc sebességgel 30 percen keresztül centrifugáljuk, és a felülúszót összegyűjtjük. A felülúszót jeges hűtés és keverés közben porított ammónium-szulfát fokozatos hozzáadásával 65 %-ra telítjük. 4 óra múlva az elegyet 12 000 fordulat/perc sebességgel 30 percen át centrifugáljuk, és a csapadékot kis mennyiségű, 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferben (pH 7,5) oldjuk. A fenti lépésben az aktivitás 98 %-át nyerjük vissza, a tisztítási fok 1,6-szeres a felülúszóhoz viszonyítva. A 30-65 %-os frakciót ezután egy éjszakán át 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) szemben dializáljuk, majd DEAE-Sephadex A-50 oszlopra (9X15 cm) visszük, melyet előzőleg a fenti pufferrel ekvilibráltunk. Az oszlopot azonos pufferrel mossuk, majd 0,2, 0,3, illetve 0,5 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) eluáljuk. Az eluálást 60 ml/óra átfolyási sebesség mellett végezzük, 15 ml-es frakciókat szedünk. Az aktív frakciókat ultraszűréssel koncentráljuk. A fenti lépésben az aktivitás 93 %-át nyerjük vissza, a tisztítási fok 38-szoros. A kiindulási anyaghoz viszonyítva az aktivitás 72 %-át nyerjük vissza, a tisztítási fok 60-szoros. A fenti módon kapott. aktív frakciókat Sephacryl S-200 oszlopra (2,5 X 85 cm) visszük, melyet előzőleg 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) ekvilibrálunk. 20 ml/óra átfolyási sebesség mellett 6 ml-es frakciókat gyűjtünk. A fenti lépésben az aktivitás 95 %-át nyerjük vissza, és a tisztítási fok 12-szeres. A kiindulási anyaghoz viszonyítva a visszanyerés 68 % és a tisztítási fok 725-szörös. Az aktív frakciókat ezután ultraszűréssel koncentráljuk, és Blue-Sepharose CL-6B-vel töltött oszlopon (5X10 cm) folyatjuk át, melyet megelőzően 0,05 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) ekvilibrálunk. Az abszorbeált frakciókat 1,0 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) eluáljuk. Az aktivitás a nem-abszorbeálódó frakciókban található. Az aktív frakciókat koncentráljuk. A fenti lépésben az aktivitás 82 %-át nyerjük vissza, a tisztítás foka 6-szoros. A kiindulási anyaghoz képest a visszanyerés 56 %, a tisztítási fok 4320-szoros. Az aktív frakciókat TSK—G3000—SWG-vel töltött oszlopra (2,1 X 60 cm, TOYOSODA Co., Ltd.) visszük, melyet előzőleg 0,3 mól/1 nátrium-szulfátot tartalmazó 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 6,8) ekvilibrálunk. Az ATF-aktivitással rendelkező frakciókat a fenti pufferrel eluáljuk. 2,0 níl/perc átfolyási sebesség mellett 2 ml-es frakciókat szedünk. A fenti lépésben az aktivitás 35 %-át nyerjük vissza, a tisztítás foka 4-szeres. A kiindulási anyaghoz képest az aktivitás visszanyerése 20%, a tisztítás foka 17280- szoros. A TSK—G3000-SWG-vel kapott frakciókat TSKDEAE—3SW töltetű nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopra (7,5X75 mm, TOYOSODA Co., Ltd.) visszük, melyet előzőleg 0,04 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 6,8) ekvilibráltunk. Az oszlopot először a fenti pufferrel, majd olyan pufferrel mossuk, melyet 0,15 mól/1 nátrium-kloriddal kiegészítettünk. Az ATF-aktivitással rendelkező frakciókat 0,15—0,5 mól/1 lineáris nátrium-klorid-gradienssel eluáljuk. 0,6 ml/perc átfolyási sebesség mellett 1,2 ml-es frakciókat szedünk. A fenti tisztított ATF poliakrilamid gélelektroforézis lemezen egyetlen sávot mulat. A fenti lépésben az aktivitás 28 %-át nyerjük vissza, a tisztítás foka 3-szoros. Az egész tisztítási művelet során az aktivitás visszanyerése 6 %, a tisztítás foka 51840-szeres. A kapott ATF specifikus aktivitása 1,0X 106 egység/nrg protein. 7. példa ATF tisztítása monoklónozott antitesttel 1. Monoklónozott hibridoma előállítása Részlegesen tisztított ATF-et szubkután módon C3H/HeN egerekbe — szükség esetén más fajtát is használhatunk — injektálunk, adjuvánssal együtt. Az immunitást heti egy immunizálással 3—4-szeresére növeljük, majd meghatározzuk az antitest-titer növekedését. A magas ATF-titerrel rendelkező egereknek adjuváns nélkül, intraperitoneálisan ATF-et injektálunk, majd 3 nap múlva az egereket leöljük és a lépet eltávolítjuk. A lépsejtek kinyerése céljából a lépet szikével feldaraboljuk és az eritrocitákat hemolízis-pufferrel eltávolítjuk. A lépsejteket egérmieloma-sejtekkel (P3-x 63-Ag 8.653 vagy P3 NS—1, a Dainippon Seiyaku Kabusiki Kaisha termékei) keverjük, 10:1 — 1:1 arányban. Mindkét fajta sejtet poli(etilén-giikol)-laI fuzionáljuk. A fuzionált sejteket»HAT szelektív táptalajban tenyésztjük, közel 2 héten át, majd a HAT táptalajból az aminopterint eltávolítva HT táptalajban tovább tenyésztjük a sejteket. A fuzionált sejt tenyészet felülúszóját és az ATF-oIdatot megfelelő hígításban egyidejűleg az L-sejt-tenyészethez adjuk. Kiválasztjuk azokat a fuzionált sejteket, amelyek képesek az ATF hatását semlegesíteni, ezeket tekintjük olyan hibridoma sejteknek, amelyek ATF-antitestet termelnek. A hibridoma klónozását korlátozott hígítási módszerrel végezzük. A klónozott sejteket ismét megvizsgáljuk, abban a fázisban, mikor a sejtek szaporodása megfelelő mértékű, és a pozitív egyedeket ismét klónozzuk. 2. Monoklónozott antitest előállítása és tisztítása, nagyobb méretekben Az ATF elleni antitestet termelő hibridoma kiónok közül kiválasztjuk a legnagyobb aktivitású kiónt. A fenti kiónt nagy léptékben tenyésztve nagy mennyiségű antitestet állítunk elő. A nagy léptékű tenyésztésre két módszer alkalmazható. Az egyik módszer szerint egereknek intraperitoneálisan 10 sejtet injektálunk, és mint aszci-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
