194584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorgátló hatású, fehérjeszerű anyag és az erre fajlagos, hordozóhoz kötött monoklonális antitestek előállítására
1 194 584 2 A találmány tárgya eljárás tumorgátló hatású, fehérjeszerű anyag előállítására, amelyet sejttenyészet feliilúszójába ürítenek a tenyésztett sejtek; a fenti anyagot olyan emlős sejtek termelik, amelyek korlátlanul képesek proliferální és az E. coli egy lipopoliszaçharidjânak hatására makrofág-típusű sejtté képesek differenciálódni. A sejtek kerek formát vesznek fel, és fagocita aktivitással rendelkeznek. Pincus W. B. [J. Reticuloendothel. Soc. 4, 122—139 (1967)] ismertette, hogy ha normális tengerimalac hasüreg! makrofágjának folyékony tenyészetéhez tisztított tuberkulin proteint adnak, a makrofágokból felszabadul egy anyag, amely tumorölő hatást fejt ki a tápközegbe vitt egér tumorsejtek ellen. A markofágok tumorölő aktivitását ezidáig a célsejtekkel való közvetlen érintkezés hatásának tulajdonították. Ezért Pincus felismerése igen jelentős, hiszen azt mutatja, hogy létezik egy folyékony intermedier anyag. Ezt követően Meitzer M. S. és munkatársai kimutatták IJ. Natl. Cancer Inst. 49, 1439-1443 (1975)], hogy ha BCG-érzékenyítéssel aktivált egér lépsejtekhez tisztított tuberkulin proteint adnak, a felülúszó folyadékban egy olyan anyag van jelen, amely nem mutat aktivitást normális magzati sejtek vagy normális fibroblaszt sejtek ellen, de az L-sejteket specifikusan elpusztítja. A fenti felismerés is igen jelentős abból a szempontból, hogy a fenti anyag nem azonos a limfocitákból kapott, nem specifikus citotoxinnal (limfotoxin), hanem specifikusan csak a tumorsejtekre hat. Carswell és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, 3666-3670 (1975)] megfigyelése szerint ha BCG-vel fertőzőt! egérnek intravénásán coli-bacillus lipopoliszacharid-toxint (LPS-t) injektálnak, a szérumba az LPS injekció után 2 órával egy olyan anyag kerül, amely L-sejteket ölő aktivitással rendelkezik. Ezen túlmenően, a szérum nem toxikus normális állatok vagy normális sejtek esetén, de ha a szérumból 0,5 ml-t Meth-A-tumoros egérbe injektálnak, vérzéses nekrózist vált ki, vagy teljes gyógyulást eredményez. Carswell és munkatársai a fenti anyagot tumor-nekrózis faktornak (rövidítve TNF- nek) nevezték el. Kimutatták, hogy a TNF molekulasúlya közel 150 000. Noha számos kiegészítő vizsgálatot végeztek — többek között Mathews N., Ruff M. R., Männel D. N., Kuli F. C. Jr. és munkatársai —, nem sikerült megállapítani, hogy a TNF egy tiszta anyag-e, vagy hasonló aktivitású anyagok elegye. Carswell és munkatársai TNF-fel folytatott vizsgálatai óta fokozott figyelmet fordítottak azokra a kutatásokra, amelyek olyan anyagok vizsgálatára irányultak, amelyek nem hatnak a normális sejtekre, csak a tumorsejtek ellen hatásosak. A kutatás iránya négy csoportra osztható, az alábbiak szerint. 1. Az első kutatási irányzat szerint egy alacsony toxicitású anyagot kerestek az LPS helyett, ennek megfelelően a kis toxieitású lipid A-t, jelölt Pseudomonas aeruginosa baktériumot vagy az LPS metanolos dezacetilezésével kapott endotoxint vizsgálták. 2. A második kutatási irányzat szerint az egér és nyúl TNF-et Carswell és munkatársai módszere szerint a humán daganat-terápiában kívánták alkalmazni. Az elgondolás alapjául az a kísérleti tény szolgált, hogy az interleukin—1 és interleukin—2, amely a TNF- hez hasonlóan szintén egy fajta limfokin, fajokra való tekintet nélkül hatásos, így feltételezhető, hogy a TNF sem f; j-specifikus, azaz az állatokból nyert TNF emberben is ;,kahnazható. Az eljárásnak az a hátránya, hogy az extrakciót a teljes szérumból kell végezni, ezért a különböző kutatók eredményei egymástól teljesen eltérőek, még a molekulasúly tekintetében is. 3. A harmadik kutatási irányzat szerint a tumorellenes hatású anyagot in vitro tenyésztett sejtek felülúszó folyadékából kívánták előállítani. Elvi alapja ugyanaz, mint a 2. irányzatban, azaz az állati sejt eredetű aktív anyag is ugyanúgy alkalmazható a humán terápiában, mint a humán sejtek által termelt anyag. 4. A negyedik kutatási irányzat szerint a tumorellenes hatású anyagot úgynevezett biotechnológia útján kívánták előállítani, oly módon, azoknak a sejteknek a messenger RNS-ét, amelyek tenyészetében antitumor aktivitású anyag keletkezik, izolálják, és coli-bacillusba vagy élesztőgombába transzformálják. A fenti módszerrel peptidláncot kaphatunk ugyan, de fennáll annak a lehetősége, hogy nem érünk el immun-toleráns hatást, mivel a cukor-lánc hiányzik. Ezért a fenti módszerrel szemben vannak kétségeink. Abban az esetben, ha a tumorellenes hatású anyagot a 3. irányzatnak megfelelően egy sejttenyészet felülúszójából nyerik, a normális állatból származó sejtek szaporodása lassú, és sorozatosan, több generáción át tenyészteni a sejteket igen bonyolult, így ez a módszer ipari megvalósításra nem alkalmas. Természetesen elképzelhető az is, hogy olyan sejteket — például tumorsejteket — használnak, amelyek gyorsan szaporodnak. Elsőként Ménnel D. N. és munkatársai [Infect, and Immun,, 30, 523—530 (1980)1 használtak ilyen sejteket. Leírták, hogy ha a makrofág-szerű PU5-1.8 sejtekhez LPS-t adnak és a sejteket 2 órán át tenyésztik, a sejtekből egy olyan anyag szabadul fel, amelynek hőstabilitása 56 °C-on 3f) perc, és molekulasúlya 50000—60000. Williamson B. D. és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Soc. USA 80, 5397-5401 (1983)] kimutatták, hogy az Epstein-Barr vírussal tumor-transzformált humán B-sejt humán TNF-et termel, amelynek molekulasúlya közel 70 000. Ohnishi és munkatársai [Vienna Intern. Chemotherapy Soc., Preprint PS 12.4. 7—26. oldal (1983)] is közölték, hogy humán B-tumorsejtekből, BALL—1 sejtekből 15 000 körüli molekulasúlyú tumorellenes anyag válik szabaddá, ha a sejteket Sendai vírussal kezelik. A találmány szerinti eljárással előállított tumorellenes hatású anyag, és a fenti ismert anyagok közötti különbségek az alábbiakban foglalhatók össze. A) A rcliculoszarcomák közül csak a fagocitáló képességgel rendelkező hisztocitákat klónozzuk és használjuk fel. A Ralph és munkatársai [Nature 257, 393-394 (1975)] által klónozott sejtek közül csak a cirkuláris sejteket klónozzuk tovább és használjuk fel. Ezek közé tartoznak a J774.1 sejtek, amelyek tenyésztésével állítjuk elő a találmány szerinti fehérjeszerű anyagokat. A fenti sejteket jellegzetes módon úgy használjuk, hogy nem engedjük meg, hogy a stimulánssal makrofággá differenciálódjanak. B) Noha a monocita formában levő sejtek az A) pontban leírtak szerint LPS, növényi lektin vagy egyéb hasonló anyag hozzáadására makrofág-szerű sejtekké képesek differenciálódni, a találmány szerinti eljárás jellemzője, hogy a tumorgátló anyag olyan sejtekből válik szabaddá, amelyek differenciálódás előtti alakkal rendelkeznek. így az extrakció egyszerű, mivel nincs jelen g, IC 15 2C 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
