194584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorgátló hatású, fehérjeszerű anyag és az erre fajlagos, hordozóhoz kötött monoklonális antitestek előállítására
194 584 2 olyan anyag — például LPS -, amelyet azután nehéz eltávolítani. C) Az A) pontban ismertetett sejtek magzati borjúszérumot tartalmazó táptalajban gyorsan szaporodnak (a sejtek száma 24 óra alatt megkétszereződik). Miután a fenti borjúszérum-tartalmú tápközegben megfelelő szaporodást értünk el, a tápközeget szérum nélküli közeggel helyettesítjük, és a sejteket néhány napon át tovább tenyésztjük, majd a felülúszó folyadékot összegyűjtjük. A találmány szerinti megoldás jellemzője, hogy mivel a visszamaradó sejtek nem szenvednek károsodást, újra felhasználhatók oly módon, hogy a szérumtartalmú tápközegbe visszavezetjük azokat, majd a tápközeget szérum nélküli tápközegre cserélve újabb felülúszó folyadékot nyerünk, és ez iparilag igen előnyös. D) A fehérjeszerű anyag szérummentes tápközegből való extrakciójakor a közegben levő főbb proteinek közül a marhaszérumalbumin és transzferrin Blue Sepharose-zal és DEAE-Scphadex-szel könnyen eltávolítható. Az ammónium-szulfát sem befolyásolja a találmány szerinti anyag tisztítását, mivel nem okoz sem polimerizációt, sem asszociációt. Ennek megfelelően egyszerűen kapható a tiszta anyag. Még ha jelen is van lizozim vagy interleukin-1 a találmány szerinti eljárással kapott felülúszó folyadékban, a fenti anyagok is könnyen elválaszthatók gélszűrés vagy ultraszűrés segítségével, mivel molekulasúlyuk 14400, illetve 15 000. E) A találmány szerinti eljárással előállított fehérjeszerű anyagot adjuvánssal együtt egér bőre alá injektáljuk, majd az állatot még egyszer érzékenyítjük, és összegyűjtjük a lépscjtekct. Ezután a iépsejteket öröklött rákos egerek B-tumorsejtjével, pontosabban P3-X63—Ag653 sejtvonallal fuzionáltatva hibridoma sejteket állítunk elő, amelyek monoklórozott antitest előállítására képesek. A fenti hibridóma sejtek által termelt monoklónozott antitestet hordozóhoz kötjük. A fenti módszert a találmány szerinti eljárással előállított anyag tisztítására és meghatározására alkalmazva az eljárás könnyen ellenőrizhető lesz. F) A találmány szerinti eljárással előállított fehérjeszerű anyag molekulasúlya 45 000±5000, izoelektromos pontja (pl) 4,8±0,3. Az anyag 56 °C-on melegítve 30 percen át stabil. Nem azonos a Williamson és munkatársai által humán B-sejtekből nyert humán TNF-fel, mivel az utóbbinak molekulasúlya 70000. Az Ohnishi által BALL—1 sejtekből előállított aktív anyagtól is különbözik, mivel annak molekulasúlya 15 000. A találmány szerinti eljárással előállított anyag fizikai-kémiai adatai tehát mind a két ismert anyagétól különböznek. G) A találmány szerinti eljárással előállított anyag nem lázkeltő hatású, nyulaknak intravénásán injektálva még nagy dózisban sem okoz rendellenes viselkedést vagy pusztulást. H) A találmány szerinti eljárással előállított anyag fiziológiai hatása eltér a telep-stimuláló faktorétól (colony stimulating factor, továbbiakban CSF), amelynek hatására a granulociták növekednek. A CSF úgy nyerhető, hogy makrofág tenyészethez stimulátort — például LPS-t, dextránt, zimozánt, tuberkulint, forbol-mirisztát-acetátot (PMA-t) vagy egyéb hasonló szert — adunk. I) Ha a PMA-t vagy LPS-t P 388D1 sejtekkel (makrofág-típusú tenyésztett sejtek) reagáltatjuk, a tenyészet 1 felülúszójában interleukin—1 keletkezik. Mivel ennek molekulasúlya 14 000, és pirogén (lázkcltő) hatással rendelkezik, vagy egy amiloid-szerű anyagot termel a szérumban, tulajdonságai nyilvánvalóan különböznek a találmány szerinti eljárással előállított anyagétól. A fentieken kívül a találmány szerinti eljárással előállított tumorellenes hatású anyag a többi, eddig ismert, sejtekből származó tumoréllenes anyagokra emlékeztető tulajdonságai a következőkben foglalhatók össze. . I) A találmány szerinti eljárással előállított anyag L-929, Meth-A, S-180 és L—1210 egér tumorsejtekre in vitro sejtölő hatást fejt ki. Ugyanakkor humán karcinomákkal (HSC—1, EAC—1 és HeLa) szemben is hasonló sejtölő hatást mutat. Ezzel szemben normális sejtekre — például humán felnőtt vagy magzati bőr-fibroblaszt sejtekre, vagy állati V—79 vagy Don-sejtekre - nem fejt ki sejtölő hatást, azaz nagy tumor-specificitással rendelkezik . K) Öröklött Meth—A tumoros BALB/c egereknek egyszerre 72 egység találmány szerinti eljárással előállított anyagot adunk, intravénás injekció formájában, mikor a tumor átmérője eléri az 5-6 mra-t. Megfigyeléseink szerint az injekció hatására nemcsak a tumorban észlelhető vérzéses nekrózis, de a limfociták beszfírődése is megszűnik. Ezután a tumor kb. 7 nap alatt felbomlik és az állatok 84 %-a teljesen meggyógyul. A teljes gyógyulási arány — Carswell 25 %-os értékével összehasonlítva — igen magas. Ha ugyanabból a tumorból 10 sejtet újra beültetünk a gyógyult egerek bőre alá, a tumor nem fogan meg. Az eredményből arra következtethetünk, hogy a tumorral szemben immunitás alakul ki. A találmány szerinti eljárással előállított fehérjeszerű anyagot a továbbiakban tumorellenes anyagnak nevezzük, és AT”-nek rövidítjük. L) Az ATF savas protein, molekulasúlya 45 000± 5000, és cukor-komponense is lehet. Tripszinnel szemben érzékeny, de melegítéssel szemben 56 °C-on 30 percen át stabil. Ribonukleáz és galaktozidáz nem inaktiválja. A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példák segítségével kívánjuk ismertetni. i. kísérlet Citotoxikus hatás meghatározása Az ATF aktivitásának mérésére célsejtként egér tumor L-sejteket használunk. Az L-sejteket 2X 105 scjl/ml koncentrációban Eagle-féle minimál táptalajban (MÉM) szuszpendáljuk, amelyet 10 % magzati borjúszérummal (FCS, hő-inaktivált) egészítettünk ki. A fenti szuszpenzióból 0,1 ml-t mérünk egy 96 lyukú mikrotitrátor-lemez minden egyes lyukába, majd a sejteket 37 °C-on 5 % szén-dioxid tartalmú inkubátorban tenyésztjük. 24 órás inkubálás után a tápközeget eltávolítjuk és négyszeres sorozat-hígításban ATF-et tartalmazó táptalajt adunk a sejtekhez, majd 48 órán át tovább folytatjuk a tenyésztést. Az élő sejtszámot eritrozinos festés után hemocitométerben mérjük. A titert úgy számoljuk ki, hogy a kontrolihoz képest 50 %-os sejtpusztulást okozó ATF hígításának reciprokát vesszük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
