194497. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daganattal és vírussal szembeni immunválasz kiváltására alkalmas kompozíció előállítására
5 194497 6 Laboratory (1980)]; Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Monoklonális antitestek és T-sejt hibridómák [G. J. Hammerling, U. Hämmerling és J. F. Kearney (1981)]; Kozbor és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79,6651-6655 (1982); Jónak és munkatársai: Hybridoma 2, 124 (1983); Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines (Monoklonális antitestek és funkcionális sejtvonalak) [R. H. Kennett, K. B. Bechtol és T. J. McKeam (1983)]; Kozbor és munkatársai: Immunology Today, 4, 72-79 (1983). Anti-Id Ab-t termelő normál B-limfocitákat, amelyek nem pusztuló B-limfocita termeléséhez alkalmasak, különböző, a szakterületen belül jól ismert módszerekkel lehet előállítani. így pl. egy állatot, pl. patkányt vagy egeret, immunizálhatunk monoklonális antitumor vagy antivirus antitesttel és anti-Id Ab-t termelő B-limfocitákat nyerünk ki az állat lépéből. Anti-Id Ab-t termelő humán B-limfocitákat nyerhetünk úgy, hogy egy beteget monoklonális antitumor vagy antivirus antitesttel immunizálunk, a betegből perifériás vérlimfocitákat gyűjtünk, majd in vitro indukáljuk az anti- Id Ab-t termelő B-limfociták növekedését, a tenyészetet monoklonális antitumor vagy antivirus antitesttel stimulálva [lásd pl. DeFreites és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 6646-6650 (1982)1 Az anti-Id Ab-t termelő állati vagy humán B-limfocitákat így kinyerhetjük és nem-pusztulóvá tehetjük a szakterületen jól ismert módszerekkel. Természetesen érthető, hogy azokat az anti-Id Ab-t termelő limfocitákat, amelyek a tumorsejt vagy vírusantigén belső képmását nyújtják, meg kell különböztetni azoktól az anti-Id Ab-t termelő B-limfocitáktól, amelyek a keret-determinánsokra irányulnak az idiotípusos területben. A jelen találmány szerinti módszer, amikor tumorokra alkalmazzuk, gyakorolható más, tumorokra immunológiai választ kiváltó módszerekkel összekapcsolva, mint pl. vírus onkolizátum vakcinák alkalmazásával, amint ez a 4,108,983 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban le van írva. A vírusokat illetőleg ha szükséges, a gazdaemlős szervezetben előállított, vírusra adott immunválaszt tovább lehet növelni hagyományos vímsvakcinákkal történő immunizálással az anti-Id Ab fentebb leírt beadásán kívül. Miután az anti-(anti-Id) Ab termelését stimuláltuk a gazdaemlős szervezetben anti-Id Ab beadásával (pl. 2 héttel a beadás után), a gazdaszervezetet egy hagyományos technikákkal, a szakterületen ismert módon előállított vírusvakcinákkal inokuláljuk (pl. elölt vírusvakcinákkal, mint pl. HDC veszettség vakcinával). Ezekkel kapcsolatban lásd: Plotkin és munkatársai: Am. J. Epidemiology, 103,75-80 (1976); Wiktor és munkatársai: Rabies Vaccine for Human Use (Veszettség elleni vakcina humán felhasználásra), 40. kötet, 3-9 (1978). A vakcinák típusai és beadásuk módszerei a szakterületen jártasság keretein belül vannak. Az itt következő példák csupán a jelen találmány bemutatását szolgálják, és ezekkel nem szándékozzuk korlátozni a találmány oltalmi körét. 1. példa - Tumor antitestek Monoklonális idiotípus antitestek A következő kísérletekben egér 17-1A, C42032 Q1472 monoklonális antitesteket alkalmaztunk, amelyek kötődnek a humán emésztőszervi ráksejtekhez, amint ezt Herlyn és munkatársai (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 1438-1442 (1979) és Koprowski leírták [„Monoclonal Antibodies In Vivo” (Monoklonális antitestek in vivo) a „Monoclonal antibodies in Cancer: Proceedings of the Fourth Armand Hammer Cancer Symposium” kiadványban (szerkesztők: B. Boss, R. Langman, I. Trowbridge és Dulbecco, 1983)] A C42032 monoklonális antitest (MAb) fajlagos a végbél (colorectalis) karcinomával (CRC) összekapcsolt Mr180, 160, 50 és 40 K antigénekre. Az MAb C4 1472 (IgG2a) fajlagos a CRC-vel összekapcsolt Mr50K antigénre. A hepatitisz vírus elleni Mab A5C3-at szintén alkalmaztuk, amint ezt Wands és munkatársai leírták. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, 1214-1218 (1981)1 A 17-1A (IgG2A, kappa könnyű lánc) és C42032 (IgG2a kappa könnyű lánc) MAb-ket hibridoma-hordozó egérből nyert ascitesből tisztítottuk aflinitás-kromatográfiával Protein A Sepharose-oszlopon (Pharmacia, Piscataway, New Jersey), amint ezt Ey és munkatársai leírták [immunochemistry, 15, 429-436 (1978)]. Betegek Minden beteg metasztatikus vagy visszatérő emésztőszervi adenokarcinomában szenvedett, és rendszeresen kaptak injekciókat egy adag tisztított, steril, pirogénmentes MAb 17-1A készítménnyel, amelyet Balb/ c egerek ascites folyadékjából koncentráltak a Sears és munkatársai által feltárt módszer szerint [Lancet, 762-765 (1982)]. Kilenc betegből, akik 192 mg vagy kevesebb MAb 17-1 A-t kaptak, hét fejlesztett ki antiegér globulin antitesteket. 20 betegből, akik 200-1000 mg monoklonális antitestet kaptak, három fejlesztett ki antiegér globulin antitesteket. Az első csoport három betegének, akik antiegér globulin molekulákat fejlesztettek (07., 08. és 09. számú betegek) és a második csoport két betegének (14. és 23. számú betegek) szérumait vagy átvizsgáltuk, vagy feldolgoztuk anti-idiotípus antitestek izolálására. A 07., 08. és 23. betegekből anti-idiotípus antitestek izolálásához alkalmazott szérumokat akkor nyertük, amikor mind a három a legnagyobb antiegér globulin antitest koncentrációit mutatta. A 08. számú beteg egy második injekciót is kapott, 130 mg monoklonális antitestet 20 hónappal az első injekció után, és ezután a második injekció után nyert szérumot használtuk az átvizsgáláshoz anti-idiotípus antitest jelenlétére. Poliklonális anti-idiotípus antitestek előállítása LJj-zélandi fehér nyulakat oltottunk be szubkután több helyen 300 mg, Freund-féle komplett adjuvánssal emulzióba vitt, tisztított MAb 17-lA-val, és 30 nappal később emlékeztető oltást adtunk 100 mg monoklonális antitesttel intramuszkulárisan. A szérumot a másodlagos válasz 10. napján gyűjtöttük össze. Antiszérumokat abszorbeáltunk immobilizált MAb C42032-n és MAb 17-lA-n. A tisztított monoklonális antitesteket (30-30 mg) 2 ml AfTi-Gel 10-hez kapcsoltuk (Bio-Rad laboratories, Richmond, Kalifornia). Az antiszérumokat azután egymás után MAb C42032 és MAb 17-1A immunabszorbensekre abszorbeáltuk, hogy eltávolítsuk az anti-izotípusos, illetve anti-idiotípusos antitesteket. Az abszorbeált antitesteket 0,1 mól/literes glicin pufferral eluáltuk (pH 2,8), foszfátpufferral azonnal semlegesítettük, foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal szemben dializáltuk és a fehéije mennyiségét 280 nm-nél mért adszorpciós képességgel mértük (E196280 = 14). A betegekből egy MAb 17-1A injekció után nyert antiszérumokat szintén feldolgoztuk és tisztítottuk, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
