194497. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daganattal és vírussal szembeni immunválasz kiváltására alkalmas kompozíció előállítására
7 194497 8 amint ezt fentebb leírtuk. A 23. számú betegtől, aki 750 mg MAb 17-lA-t kapott, és a 08. és 07. számú betegektől, akik 133 illetve 125 mg MAb 17-lA-t kaptak, szérumokat gyűjtöttünk különböző időpontokban az antitest első beinjektálásától számítva. Azokat a mintákat, amelyekről radioimmunassay elemzéssel kimutatható, hogy antirágcsáló IgG antitestet tartalmaznak, egymás után abszorbeáltuk MAb C42032, illetve MAb 17-1A immunabszorbenshez, hogy eltávolítsuk az anti-izotípusos, illetve az anti-idiotípus antitesteket, amint ezt fentebb leírtuk. A szérumból izolált antiidiotípus antitestről kimutatható, hogy humán immunglobulin, a kimutatást 125I-vel jelzett antihumán F/abV2 fragmensekhez való kötődéssel végezve. Az anti-idiotípusos fehéije kitermelése a szérummintákból a következő értékek között változott: 13 //g/ml a 08. számú mintából; 8,9 pg/rsú a 07. számú mintából; és 43 /tg/ml a 23. számú mintából. A legnagyobb mennyiséget a 23. számú mintából nyertük, amely az antiegér globulin antitestek legnagyobb szintjét is mutatta. A szérumok átvizsgálása anti-idiotípus antitestek jelenlétére A szérumminták átvizsgálásához anti-idiotípus antitestek jelenlétére versengő (kompetitiv) vizsgálatot hajtottunk végre nyúl-anti-idiotípus antitestet és négy, l25I-vel jelzett MAb 17-lA-val előindukált humánszérumot alkalmazva. 1/4 hüvelyk (6,33 mm) méretű polisztirol gyöngyöket (Precision Plastic Ball Co., Chicago, Illinois) mostunk háromszor 95%-os etanollal. A levegőn megszárított gyöngyöket inkubáltuk vagy nyúl, vagy humán anti-idiotípus antitestek egy hígításával 0,02 mól/literes nátrium-tetraborátban (pH 8,2). Egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után enyhe rázással, a gyöngyöket háromszor mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal, majd legalább három órán át inkubáltuk szobahőmérsékleten foszfáttal pufferolt sóoldattal, amely még 25 bovinszérum albumint és 0,04%NaN3-at tartalmazott. A gyöngyöket ezután I25I-vel jelzett MAb 17-lA-nak mint a referencia-idiotípusnak tettük ki, amelyet előzőleg előinkubáltunk humán anti-idiotípus antitest lehetséges forrásával, vagyis humán szérumot hígítottunk 25% koncentrációra foszfáttal pufferolt sóoldattal Ca++ és Mg++ nélkül, és kiegészítve 25 szarvasmarha-szérum albuminnal és 0,04% NaN3-al. További egy éjszakán át végzett inkubálás után a gyöngyöket mostuk, és a kötött radioaktivitást gammaszámlálóban mértük. A monoklonális antitesttel végzett egy injektálás után nyert szérumokból három (23., 09. és 14. számú) mutatja az MAb 17-1A kötésének gátlását, amely nagyobb volt, mint az elő-monoklonális antitest injekcióminták gátlása. A 14. számú beteg utó-monoklonális antitest szérumánál nyert kötés-gátlási értékek kicsik voltak a másik hét szérum értékeihez hasonlítva, de nagyobbak voltak, mint az azonos beteg pre-monoklonális antitestnek kitevési szérumához tartozó érték. A 08. számú betegből nyert szérumhoz tartozó gátlási értékek hét nappal azután, hogy a beteg a monoklonális antitest második injekcióját megkapta, már nagyok voltak. Versengő mérés az anti-idiotípus kimutatására Versengő mérést hajtottunk végre ahhoz hasonló módon, amelyet fentebb leírtunk az izolált anti-idiotípus antitestek kötésének meghatározásához MAb 17-lA-hoz, valamint a C420 32, C41472 és A5C3 monoklonális antitestekhez. Az eredmények azt jelezték, hogy három szérumból (08., 07. és 23. számú) nyert anti-idiotípus antitestek kötése MAb 17-lA-hoz jelentősen nagyobb volt, mint a másik három monoklonális antitesthez, amelyek közül kettő (C42032 és C41472) szintén mutatott ki antigén helyeket a végbél karcinoma sejteken. Ezek a helyek azonban különböznek az MAb 17-1A által felismert helyektől. Mind a három beteg MAb 17-lA-val végzett injektálás előtti szérumából izolált immunglobulint mintegy 2,5 /tg/ml-re koncetráltuk és polisztirol gyöngyökhöz kötöttük. Ezek a készítmények azonban nem kötődtek a vizsgált monoklonális antitestek egyikéhez sem, jelezve az anti-idiotípus antitestek távollétét az injektálás előtti szérumban. Kereszt-reaktivitás humán anti-idiotípus antitestek között Versengő vizsgálatot hajtottunk végre, hogy meghatározzuk, vajon van-e kereszt-reaktivitás a humán anti- Id szérumok között. A versengő vizsgálatok eredményei, amelyeket alább bemutatunk, jelentős kereszt-reaktivitást jeleznek a 07. és 23. betegek anti-idiotípus szérumai között, és valamivel kisebb (de még jelentős) kereszt-reaktivitás van a 08. és 23. számú betegek anti-idiotípus szérumai között. Hasonló kereszt-reaktivitást találtunk a 07. számú beteg anti-idiotípus szérumai és a 08. számú betegből nyert poszt-monoklonális antitestszérum között. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a különböző betegek által termelt anti-idiotípus antitestek azonos antigénhelyek ellen irányulnak. 1. Antitest 2. Antitest széruma a: cmp kötött 17-1A MAb kötés százalékos gátlása Semminek 4297 anti-Id 23 07. sz. betegnek pre-4595 0 poszt-1231 71 08. sz. betegnek pre-4097 5 poszt-2585 40 Anti-idiotípus antitest által kimutatott epitop Humán anti-idiotípus antitestek kötésének haptén elhelyezését MAb 17-lA-hoz hajtottuk végre, hogy kimutassuk, hogy az anti-idiotípus antitestek az idiotípus antitest parotopjára irányulnak. Végbélrákból származó SW 1222 sejtvonal sejtjeinek 3 mól/literes KCl-es extraktumát készítettük el, amint ezt Herlyn és munkatársai leírták [j. Clin. Immunoi. 2, 135-140 (1982)1 A készítmény kötődött MAb 17-lA-hoz, jelezve, hogy az anyag az antigént tartalmazza oldható formájában. ,25I-vel jelzett MAb 17-lA-t inkubáltunk a CRC sejt extraktummal és melanoma sejtek 3 mól/literes KC1 extraktumával, amely nem köti az MAb 17-lA-t. Az antitest-antigén keveréket ezután a 23. számú betegből nyert anti-idiotípus antitesttel burkolt gyöngyökhöz adtuk, és a kötést összevetettük az egyedül radioaktív monoklonális antitesttel történő kötéssel. A kísérleteket nem telítő mennyiségű jódozott monoklonális antitesttel hajtottuk végre abból a célból, hogy kimutassuk a változásokat kompetitiv haptének kis mennyiségével történő kötésben. Kontroll céljaira a jódozott MAb 17-lA-t összekever-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
