194408. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a vankomicinek csoportjába tartozó antibiotikumok meghatározására szilárd fázisú receptoron az ennek végrehajtásához szükséges hordozó eszközök és anyagkészlet
1 194 408 2 legesítjük és pH 7,3 PBS-sel négyszeresére hígítjuk. Ebből a keverékből 0,5 ml-nyi mennyiségeket ampullákba töltünk, liofdizálunk és -80 °C-on tartunk. A konjugátum előállított mennyisége elegendő ahhoz, hogy több, mint 10,000 mikrotitráló lemezt — lemezenként 96 üreggel - vonjunk be vele. 2. példa Mikrotitráló lemezek bevonása BSA-epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala-val A mikrotitráló lemezek hetenkénti előkészítéséhez alkalmazható törzsoldatot állítunk elő olymódon, hogy egy ampulla tartalmát — az előző példában leírt módon előállított liofilizált BSA-epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala-t 0,5 ml pH 7,3 PBS-ben oldjuk fel. Ez az oldat heteken át tárolható aktivitás-vesztés nélkül, ezért alkalmas törzsoldatként való felhasználásra, egy-egy heti munka előkészítése során. A mikrotitráló lemezek üregeit 100 pl/üreg menynyiségű, ebből a törzsoldatból készített 1/2000 hígítással töltjük meg, egy függőleges mélyedés-sor kivételével (ez célszerűen az utolsó sor), amelyet vakpróbaként tartunk fenn. Ezeket a vak üregeket 100 pl pH 7,3 PBS-sel töltjük meg. A mikrotitráló lemezeket 3 órán át szobahőmérsékleten egy zárt dobozban inkubáljuk, majd desztillált vízzel való megtöltéssel és kiürítéssel ötször mossuk. Ezután 200 /ul/mélyedés mennyiségű 3%-os BSA-t — pH 7,3 PBS-ben — adagolunk és a rendszert 2 órán át szobahőmérsékleten az adszorpció lefolytatására állni hagyjuk, a be nem vont műanyag-felületek blokkolására. A lemezeket ismét mossuk desztillált vízzel, rázással szárítjuk és felhasználásig 4 °C-on tároljuk. 3. példa A HRP-teikoplanin előállítása a) A teikoplanin jelölése torma-peroxidázzal (HRP) A teikoplanin torma-peroxidázzal való jelölése egy „kétlépéses eljárással” történik, bifunkcionális keresztkötő reagensként glutáraldehid felhasználásával. 20 mg teikoplanint 2 ml pH 11,5 0,1M nátriumkarbonát oldatban oldunk és az oldatot hozzáadjuk 0,2 ml 25%-os vizes glutáraldehid oldathoz. Az elegyet 1M HCl-dal semlegesítjük és 0,9%-os NaCl oldatta] szemben alaposan dializáljuk (legalább háromszor váltva az oldatot). Ezután 10 mg torma-peroxidáz 0,5 ml pH 9,5 0,5M nátriumkarbonát/hidrogénkarbonát pufferrel elkészített oldatát adagoljuk be és az elegyet 3 órán át 37°C-on kevertetjük. A nem reagált aktív csoportok blokkolására 0,5 ml 1M lizint adagolunk (15 óra4°C-on). b) A HRP-teűcoplanin gélszűrése Az előbbi módon előállított HRP-teikoplanin konjugátumból 1,5 ml-t pH 11-re állítunk be és hűtött Sephacryl S 200 oszlopon (0,8 cm x 100 cm) pH 11 PBS pufferrel hozzuk egyensúlyba, majd ugyanezzel a pufferrel 20 ml/óra áramlási sebessiég mellett eluáljuk. Az eluálást spektrofotometriásán követjük, feljegyezve a 280 nm-en megfigyelhető áteresztési. 4*0-on kb. 2,5 ml-es frakciókat szedünk. A csúcsnak megfelelő frakciókat - vagyis azokat, amelyek a megfelelő kromogén reagenssel vizsgálva a maximális szín-kifejlődést mutatják (összeöntjük és 1 M HCl-val azonnal semlegesítjük. c) A HRP-teikoplanin affinitáskromatográfiája Az alábbi eljárással kapott frakciókat tovább tisztítjuk, egy D-alanil-D-alanin-epszilon-aminokaproil-Sepharose oszlopon (0,8 cm x 10 cm) végzett affinitáskromatográ fiával; az oszlopot előzetesen pH 7,3 PBS-sel hozzuk egyensúlyba. 40 ml/óra áramlási sebességgel való feltöltés után az oszlopot az ekvilibráló pufferrel mossuk, majd pH 11 PBS-sel eluáljuk. Az eluálást spektrofotometriásán követjük, rögzítve a 280 nm-en megfigyelhető áteresztést. 2 ml-es frakciókat szedünk. A csúcsnak megfelelő frakciókat öszszeöntjük, 1M sósavval semlegesítjük és meghatározzuk a teikoplanin-HRP konjugátum enzimaktivitását. A legaktívabb frakciókból mintát veszünk, és ezeket —80^C-on tároljuk. d) A HRP-teikoplanin aktivitás meghatározása Az előbbiek szerint előállított HRP-teikoplanin készítményekből PBTBA pufferrel (pH 7,3 PBS, amely 3% BSA-t, 0,5% TweenR 20-at, 10 mM benzamidint és 2 mg/ml 8-anilino-l-naftalin-szulfonsavat tartalmaz) sorozathigításokat készítünk. Mindegyik minta-higításból 100 pl-t adagolunk, lyukanként, a BSA-epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala-val bevont mikrotitráló lemezek egy-egy vízszintes sorába és szobahőmérsékleten, 2 órán át zárt boxban inkubáljuk ezeket a lemezeket. A lemezeket ezután 0,05% TweenR 20-at tartalmazó pH 7,3 PBS-sel való megtöltéssel és kiöntéssel nyolcszor mossuk és rázással szárítjuk. Mindegyik lyukba 200 pl kromogén oldatot (1 mg/ml o-feniléndiamin, 5 mM H2 02 0,1M nátriumcitrát puffer - ben, pH 5) adagolunk. 30 perces állás után (szobahőmérsékleten) az enzim-reakciót megállítjuk, lyukanként 50 pl 4,5M kénsav hozzáadásával. 15 perc elteltével 492 nm-en mérjük az egyes mélyedésekben található minta optikai sűrűségét. A minták aktivitását azzal a higítási faktorral fejezzük ki, amely 0,100- —0,200 optikai sűrűség egységet biztosít. 4. példa A teikomlanint tartalmazó szérum-minták vizsgálata a) A hígító puffer elkészítése 100 ml pH 7,3 foszfát puffer sóoldathoz (PBS) hozzáadunk 200 mg 8-anilino-l-naftalin-szulfonsavat (ANSA), 0,5 ml TweenR 20-t és 3 g szarvasmarha-szérumalbumint. Ezt az elegyet az oldódás megtörténtéig óvatosan kevertetjük és a pH-t 7,3-re állítjuk be. b) A hígított vizsgálandó szérum elkészítése 1 ml humán szérumot hígítunk 9 ml előbbi hígító pufferrel. c) A standard oldat előállítása Kb. 5 mg-os (pontosan lemért) teikoplanin mintákat üveg kémcsövekbe viszünk át, 0,5 ml dimetil-formamidot adagolunk és az anyagot rázással vagy ultrahangos kezeléssel oldatba visszük. Ezt követően pH 7,3 PBS-t adunk hozzá 2,0 mg/ml koncentráció eléréséig. Az oldatot pH 7,3 PBS-sel hígítjuk a következő teikoplanin hígítások előállítására: 8, 4, 2, 1, 0, 0,5, 0,25, 0,125, 0,062, 0,031 pl/ml. A nulla standard a hígított humán szérum. d) A HRPrteikoplanin oldat készítése A 3. példa szerint előállított HRP-teikoplanlnt a higító pufferrel 1—70-szeresre hígítjuk. e) A Kromogén oldat előállítása 10 pl 36%-os (súly/térf.) H2 02 oldathoz 20 ml pH 5 0,1M nátriumcitrát puffert adunk, amely 20 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
