194408. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a vankomicinek csoportjába tartozó antibiotikumok meghatározására szilárd fázisú receptoron az ennek végrehajtásához szükséges hordozó eszközök és anyagkészlet
1 194.408 2 mg o-feniléndiamint tartalmaz. f) A vizsgálandó minták előkészítése A szérum vagy plazma mintákat a higító pufferrel l :10 arányban tágítjuk. g) Meghatározási eljárás Az egyes standard oldatokat (0,5 ml) - ideértve a nulla oldatot is -, valamint a vizsgálandó mintákat (0,5 ml) műanyag kémcsövekbe visszük át. Mindegyikhez hozzáadunk 0,5 ml, az előbbi módon előállított HRP-teikoplanin oldatot és az elegyeket öszszekeveijük. Mindegyik ilyen oldatból 100—100 /rl-t - három párhuzamosban — beadagolunk a 2. példa szerint előállított, üSA-epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala-val bevont mikrotitráló lemezek üregeibe. A mikrotitráló lemez „vak helyeire” nulla standard oldatokat adagolunk. A lemezeket 2 órán át szobahőmérsékleten nedves kamrában inkubáhuk és alaposan - hatszor - mossuk 0,05% TweenR 20-at tartalmazó PBS-sel való megtöltéssel és kiürítéssel. A mikrotitráló lemezeket ezután rázással megszárítjuk. Mindegyik lyukba 200 jul, az előbbiekben említett kromogén oldatot adagolunk. 30 perc elteltével a színkifejlesztő enzim-reakciót leállítjuk, lyukanként 50 pl 4,5M kénsav hozzáadásával. 15 perc elteltével 492 nm-en mérjük az egyes üregekben levő oldat optikai sűrűségét. h) Az eredmények kiértékelése A vak, a standard oldatok és a meghatározandó minták optikai sűrűségének középértékeit külön határozzuk meg. A vak optikai sűrűség értékét kivonjuk a standardból és a meghatározandó mintákból, majd meghatározzuk az egyes minták kompetíciós arányát olymódon, hogy az így kapott optikai sűrűségértékeket osztjuk a nulla standard optikai sűrűségével. A vizsgálandó minták teikoplanin tartalmát úgy határozzuk meg, hogy a kalibrációs görbén interpoláljuk a megfelelő kompetíciós arány értékeket. A kalibrációs görbét célszerűen log-log papíron rajzoljuk fel olymódon, hogy'az egyes standard minták kompetíciós arányához tartozó megfelelő teikoplanin koncentrációt tüntetjük fel. Alkalmazási tartomány; (ismételt kísérletek alapján): 0,05—40 jug/ml. Előnyben részesített alkalmazási tartomány: 0,1 — —30 pg/ml teikoplanin. Pontosság:- a vizsgálat során: CV% 7,2- a vizsgálatok között: CV% 11,2. Ismételhetőség:- a kinyerés értéke 87—125%. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás egy, a vankomicin osztályba tartozó antibiotikum, valamely faktora, származéka vagy aglükonja meghatározására, azzal jellemezve, hogy analitikai „hordozó és/vagy tároló eszközök” felületére passzívan abszorbeáltatunk egy makromolekuláros polipeptid hordozóval konjugált, meghatározott D-alanil-D-alanin karboxil-terminálissal rendelkező oligopeptidet, egyidejűleg vagy ezt követően hozzáadjuk a meghatározandó mintát és a jelzett meghatározandó anyag egy ismert mennyiségét és egy standard görbe alapján - amelyet a meghatározandó anyagból vett ismert mennyiségek meghatározása segítségével vettünk fel - meghatározzuk a szilárd fázisú rendszerhez kötődött jelzett meghatározandó anyag mennyiségét. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a D-alanil-D-alanin karboxil-terminálissal rendelkező Oligopeptid konjugátumot korlátozott mennyiségben alkalmazzuk a meghatározandó anyag és a jelzett meghatározandó anyag öszszes mennyiségéhez képest és a meghatározandó mintát és a jelzett meghatározandó anyag ismert mennyiségét egyidejűleg adjuk hozzá az abszorbeálódott szilárd fázishoz. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a D-alanil-D-alanin karboxil-terminálissal rendelkező oligopeptid konjugátumot olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy abban a kötődési helyek száma nagyobb legyen, mint a meghatározandó anyag mennyisége szempontjából szükséges érték, a meghatározandó anyagot és a jelzett meghatározandó anyagot egymás után adagoljuk és a jelzett meghatározandó anyagból akkora mennyisé-Í;et veszünk, hogy az megköti az említett abszorbeáódott konjugátumban rendelkezésre álló valamennyi kötődési helyet. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy meghatározandó anyagként valamely, a vankomicin osztályba tartozó antibiotikumot, közelebbről vankomicint, teikoplanint, aktaplanint, avoparcint, aktinoidint, LL-AM-374-et, A 477-et, OA 7653-at, A 35512 B-t, A 515668-at, AAD 216-ot, A 41030-at, A 47934-et, vagy ezek egy különálló faktorát, származékát, vagy aglükonját alkalmazzuk. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy meghatározandó anyagként teikoplanint alkalmazunk. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy D-alaníl-D-alanin karboxi-terminálissal rendelkező olígopeptidként epszilon-aminokaproil-D-alanil-D-alanint alkalmazunk. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy makromolekuláris polipeptid hordozóként egy fehérjét alkalmazunk. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy makromolekuláris polipeptid hordozóként albumint alkalmazunk. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy analitikai „hordozó és/vagy tároló eszközök”-ként mikrotitráló lemezek üregeit, kémcsöveket vagy műanyag lapokat alkalmazunk. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy analitikai „hordozó és/vagy tároló eszközök”-ként polietilén vagy polisztiro] mikrotitráló lemezeket alkalmazunk. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jelző elemként a jelzett meghatározandó anyagban enzimet alkalmazunk. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a jelzett meghatározandó anyag jelző elemeként torma-peroxidázt alkalmazunk. 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a) foszfát puffer sóoldat -PBS -, szarvasmarha szérumalbumin -BSA - és egy felületaktív szer, pl. polietilénoxid-szorbitán-monolaurát - TweenR 20 - alkalmazásával pH 7,0-7,5 higító puffert állítunk elő; b) a vizsgálandó antibiotikumból skaláris standard hígításokat készítünk - ideértve a nulla standard értéket is — a pH 7,0-7,5 foszfát puffer sóoldat —PBS- és a hígított szérum alkalmazásával; c) a vizsgálandó szérummintákat az említett higító 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
