194315. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új szénhidráttartalmú antibiotikumok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 • kiürülés sebességét, a beteg állapotát, a gyógyszerkombinációkat, az érzékenységet és a betegség súlyosságát kell flgyelembevennie. Az adagolás történhet folyamatosan vagy periodikusan a maximális tolerált dózison belül. Az adott körülményeknek megfelelő optimális alkalmazási arányt a kezelő orvos könnyen megállapíthatja a hagyományos dózismeghatározó vizsgálatok segítségével. A következő példák a találmányt szemléltetik. Az oszlopkromatográfiás, a közepes nyomású folyadékkromatográfiás eljárásokhoz és a kicsapáshoz használt oldószerek nem voltak újradesztilláltak. A kloroform, széntetraklorid és metanol analitikai minőségű volt. A víz egy Millipore 4 szakaszos reagens fokú vízrendszeren keresztülbocsájtott deionizált vizet jelent (18 megohm Milli-O-víz). Az acetonitril és dimetilszulfoxld a nagynyomású folyadékkromatográfiás eljáráshoz megfelelő minőségű volt. A Skellysolve B-t a Getty Oil-tól vásároltuk és nem tisztítottuk tovább. Az ammónium-acetát Fischer által garantált ÁCS minőségű volt. Az oszlopról lejövő eluátumot (általában 50 ml-es frakciókban gyűjtöttük), 405—435 nm-nél ISCO UV-detektorral vizsgáltuk. A részek térfogatrészek. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatokat Whatman LK5DF vagy LK6DF kovasavgél lemezeken (20 mx20cmx0,25 mm) végeztük. A lemezeket Desaga vékonyréteg-kromatográfiás kádakban fejlesztettük ki. A kádakba 100 ml oldószert tettünk, és hagytuk, hogy az egyensúly beálljon, mielőtt a lemezt behelyeztük. A kifejlesztett levegőn szárított lemezeket 355 nm-es UV fényben vizsgáltuk. Az IR-spektrumokat Beckman 4230-as IR készüléken, az UV-spektrumokat pedig Beckman Acta III UV-készüléken vettük fel. Az *H és 13C NMR-spektrumokat Brucker WM-360 készüléken, 360 és 90 MHz-nél mértük. A kémiai ionizációs tömegspektrumokat Hewlett-Packard HP 5985B műszeren vettük fel, reagens gázként metánt alkalmazva. A térdeszorpdós kis- és nagyfelbontású tömegspektrumokat Varian M AT-731 készüléken mértük. 1 1. példa Az AT2433antibiotikum komplex termelésének fermentációs feltételei Törzstenyészet: Az Actinomadura melliaura ATCC 39691 törzstenyészetét fagyasztott teljes tenyészet formájában tároltuk. Oltóanyag előállítása A) Első oltási szakasz: Az Actinomadura melliaura (ATCC 39691) felolvasztott törzsszuszpenziójából egy 5 térfogat%-os oltóanyaggal oltottunk be 70 ml A táptalajt (marhakivonat 3,0 g, tripton 5,0 g, élesztőkivonat 5,0 g, cerelóz 1,0 g, burgonyakeményítő 24.0 g, kalcium-karbonát 2,0 g, csapvfz 1000 ml, pH 7,6 nátrium-hidroxiddal beállítva) egy 300 ml-es Hrlenmeyer lombikban. A lombikot 30°C-on 48 órán át inkubáltuk egy 300-s fordulatszámú, 5 cm löketű rázógépen. B) Második oltási szakasz: 500 ml A táptalajt az első oltási szakaszból vett inokulum 25 ml-éveí (5 tf%) oltottunk be egy 2 literes Erlenmeyer lombikban, és az A) szakasz szerint inkubáltuk. C) Fermentálás: egy 14 literes fermentorban 10 liter fermentációs B táptalajt (élesztőkivonat, 5,0 g, NZ-amin 5,0 g, cerelóz 10,0 g, oldható keményítő 20.0 g, kalcium-karbonát 4,0 g, csapvíz 1000 ml, 2 CoCl2 c: 10-3 M, 1,0 ml) 70 ml második oltóanyaggal beoltunk. A fermentációt 96 órán át 30°C-on, 350-es fordulattal keverve és 0,35 térfogat levegővel levegőztetve végezzük. Az AT 2433 komplex antibiotikum termelését a tenyészetnek a Micrococcus luteus ATCC 9341 vagy Staphylococcus aureus 209P törzsekkel szembeni hatásának neómicin meghatározására szolgáló agárban (BBL) való mérésével követtük. D) Elkülönítés 110 liter fermentlevet 2x110 liter etil-acetáttal extrahálunk. Az etil-acetátos extraktumokat egyesítjük, és az oldószert vákuumban lepároljuk, így 32,6 g nyers, szilárd AT 2433 antibiotikum komplexet kapunk. 2. példa Az AT2433 komplex antibiotikum AT2433 A Mi *A2)és AT2433 B (Bt *B%) antibiotikumokra bontása A) A nyers, szilárd AT 2433 komplex antibiotikum folyadékok közötti megosztása A nyers, szilárd AT 2433 komplex antibiotikumot (32,6 g), amelyet az 1. példában kapunk, 200 ml Skellysolve B-ben és 200 ml metanolban oldjuk Cole-Palmer (Model 8845-60) ultrahangos tisztítóban. Az oldatot 1 literes választótölcsérbe visszük, és 22,2 ml vízzel hígítjuk. Az elegyet összerázzuk, és hagyjuk, hogy a fázisok elváljanak. Az (alsó) vizes-metanolos fázist egy második választótölcsérbe visszük és még két alkalommal 200-200 ml Skeüysolve B-vel extraháljuk, amelyet előzőleg 10 térfogat% vizet tartalmazó metanollal telítettünk. A vizes metanolos fázist 44,4 ml vízzel hígítjuk, és 3 alkalommal 200—200 ml széntetrakloriddal extraháljuk, amelyet előzőleg azonos térfogatú, 25% vizet tartalmazó metanollal telítettünk. A vizes metanolos fázist 41 ml vízzel hígítjuk, és 6 alkalommal 200-200 ml kloroformmal extraháljuk. A kloroformot előzőleg 35 térfogat% vizet tartalmazó metanollal telítettük. A kloroformos extraktumokat összeöntjük, és forgó bepárlóban vákuumban szárazra pároljuk, így 5,45 g A maradékot kapunk, amely mind a négy AT 2433 komponenst, így az Aj-t, A2-t, B^t, és a B2 -t is tartalmazza. B) Az A maradék oszlopkromatografálása Egy 6 literes választótölcsérben a következő oldószereket rázzuk össze: 2160 ml kloroform, 2160 ml metanol és 1620 ml víz. A kapott fázisokat elválasztjuk. Az alsó fázist használjuk az oszlop- és vékonyréteg-kromatografáláshoz eluálószerként. Egy 2 cm belső átmérőjű és 100 cm magas oszlopot (Glenco, 3500 Universal LC Column) 140 g Woelm kovasavgél (0,032—0,063 mm) fenti eluálószerrel készült szuszpenziójával töltünk meg. Az A maradék 5,45 g-ját 10 ml eluálószerben oldjuk, és a 15 ml-es mintatartóba visszük. A mintatartót összekapcsoljuk a közepes nyomású folyadékkromatográfiás rendszerrel. Az eluciót kb. 21/ml/perc átfolyási sebességgel kezdjük, és a következő frakciókat szedjük: 1. frakció 180 ml, 2. frakció 100 ml, 3. frakció 50 ml, 4—33. frakció 75—75 ml. Minden frakcióból 25 mikrolitert Whatman LK6DF kovasavgél vékonyréteg-kromatogrflás lemezre viszünk. A lemezeket az eluálószerrel fejlesztjük ki, és UV fényben 366 nm-nél vizsgáljuk. A 7—14. frakciókat összeöntjük és forgóbepárlóban vákuumban bepároljuk, így 1,4 9 194 315 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
